S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Indledning
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, det forårsagende middel til sen rødme, den mest økonomisk vigtige sygdom hos kartofler og tomater, har tiltrukket opmærksomhed fra forskere fra forskellige lande i mere end et og et halvt århundrede. Pludselig optrådte i Europa i midten af det XNUMX. århundrede og forårsagede en kartoffelepidemi, der er blevet husket i mange generationer.
Indtil nu kaldes det ofte "den irske sultes svampe". Næsten hundrede år efter de første epidemier blev der opdaget vilde mexicanske kartoffelarter, der var resistente over for sen kyst, metoder til at krydse dem med dyrkede kartofler blev udviklet (Muller, 1935), og de første sorter med resistente sorter blev opnået. Kort efter starten af deres kommercielle dyrkning akkumuleredes imidlertid løb med det sene røde patogen, der var virulent over for resistente sorter. og introduktionen af nye resistensgener fra vilde mexicanske kartofler i sorter begyndte hurtigt at miste effektiviteten.
Fejl ved brugen af monogen (lodret) modstand tvang opdrættere til at lede efter mere komplekse måder at udnytte uspecifik polygen (vandret) modstand på. I de senere år er meget aggressive racer begyndt at samle sig i individuelle populationer af parasitten, hvilket forårsager erosion af endog uspecifik modstand. Fremkomsten af fungicidresistente stammer har skabt problemer i brugen af kemikalier til beskyttelse af kartofler.
På grund af de signifikante forskelle mellem oomyceter og svampe i kemisk sammensætning, ultrastruktur og stofskifte er fungicider, især systemiske, der bruges til at beskytte planter mod mange svampesygdomme, ineffektive over for oomycetes.
Derfor blev der anvendt flere gange (op til 12 gange pr. Sæson eller mere) sprøjtning med kontaktpræparater med et bredt handlingsspektrum i den kemiske beskyttelse mod sen rødme. Et revolutionerende skridt var brugen af phenylamider, som er giftige for oomycetes og spredes systemisk i planter. Imidlertid førte deres udbredte anvendelse hurtigt til akkumulering af resistente stammer i svampepopulationer (Davidse et al., 1981), hvilket betydeligt komplicerede plantebeskyttelse. P. infestans er praktisk talt den eneste parasit i den tempererede zone, hvis skade organisk landbrug ikke kan neutraliseres uden brug af kemiske beskyttelsesmidler (Van Bruggen, 1995).
Ovenstående forklarer den enorme opmærksomhed, som forskere fra forskellige lande lægger på undersøgelsen af P. infestans-populationer, dynamikken i deres overflod og genetiske sammensætning såvel som de genetiske mekanismer for variation.
Livscyklus for R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans udvikler et intercellulært mycelium med haustoria inde i kartoffelblade. Fodring på bladvæv forårsager dannelsen af mørke pletter, der bliver sorte og rådner i vådt vejr. Med et stærkt nederlag dør hele bladet. Efter en periode med fodring dannes der udvækst på myceliet - sporangioforer - der vokser udad gennem stomataen. I vådt vejr danner de en hvid blomst omkring pletterne på undersiden af bladene. I enderne af sporangioforerne dannes der citronformet zoosporangia, som bryder af og bæres ved spray af regn (fig. 1). Kom i dråber vand på overfladen af et kartoffelblad, sporangia spirer med 6-8 zoosporer, som efter en bevægelsesperiode er afrundet, dækket af en skal og spire med et spirerør. Spiren trænger gennem bladvævet gennem stomataen. Under visse betingelser kan sporangier vokse i et vækstrør direkte ind i bladvæv. Under gunstige forhold er tiden fra infektion til dannelsen af ny sporulation kun 3-4 dage.
En gang på jorden og filtreret gennem jorden er sporangia i stand til at inficere knolde. Alvorligt berørte knolde rådner under opbevaring; i de svagt ramte kan infektionen vare indtil næste sæson. Derudover kan det forårsagende middel til sen rødme fortsætte om vinteren i form af oosporer (tykvæggede hvile seksuelle sporer) i jorden på planterester og på tomatfrø. Oosporer dannes på levende organer af planter, når stammer af forskellige typer parring mødes med overdreven fugt. Om foråret dannes aseksuel sporulering på plantede inficerede knolde og på planterester med oosporer; zoosporer kommer ind i jorden og forårsager infektion i de nedre blade af planter. I nogle tilfælde kan myceliet vokse fra den inficerede knold langs den grønne del af planten og vises normalt i den øverste del af stilken.
En væsentlig forskel mellem oomycetes og de fleste svampe ligger i overvejelsen af diplofase i deres livscyklus med gametisk meiose og spiring af zygoter (oosporer) uden reduktiv nuklear fission. Denne funktion, plus dipolar heterotallisme, der erstatter biseksualitet, ser ud til at gøre det muligt at anvende til oomycetes de tilgange, der er udviklet til at studere populationer af højere eukaryoter (analyse af panmixia og underinddeling af populationer, intra- og interpopulationsgenstrømme osv.). Imidlertid tillader tre faktorer ikke fuldstændig overførsel af disse tilgange, når man studerer P. infestans-populationerne.
1. Sammen med hybride oosporer dannes selvfertile og parthenogenetiske oosporer i populationer (Fife og Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), og hyppigheden af deres dannelse kan være tilstrækkelig til at påvirke på testresultaterne.
2. Den seksuelle proces i P. infestans yder et ubetydeligt bidrag til dynamikken i befolkningsstørrelsen, fordi svampen hovedsageligt reproducerer af vegetative sporer og danner mere end 90% af resultaterne af analysen af parringstypen ved den traditionelle metode på et næringsmedium ... vækstsæsonen flere generationer af aseksuel sporulation (polycyklisk sygdomsudvikling). Oosporer spiller en vigtig rolle i bevarelsen af organismen i den periode, hvor der ikke er grønne planter (om vinteren) og i den primære infektion af kimplanter. Derefter, om sommeren, forekommer klonal reproduktion og en stigning eller omvendt et fald i antallet af individuelle kloner, der er opstået som et resultat af seksuel rekombination, hvilket hovedsageligt bestemmes af udvælgelsen af de mere tilpassede. Derfor kan forholdet mellem individuelle kloner i en population i begyndelsen og slutningen af epifytotika være helt anderledes.
3. Den beskrevne cyklus er karakteristisk for de oprindelige populationer af P. infestans i deres hjemland, Mellemamerika. I andre områder af verden var den seksuelle proces ikke kendt i mere end 100 år; det vegetative mycelium i inficerede kartoffelknolde var overvintringsstadiet. Livscyklussen var fuldstændig agamisk, og spredningen var i fokus: infektionen fra enkeltinficerede plantede knolde blev sendt til bladene og dannede primære foci af sygdommen, som kunne smelte sammen under sygdommens massive udvikling.
I nogle regioner kan der således være en veksling af seksuelle og aseksuelle cyklusser, mens i andre - kun aseksuelle cyklusser.
Oprindelse af P. INFESTANS
P. infestans dukkede op i Europa i slutningen af første halvdel af det 1991. århundrede. Da kartoflen er hjemmehørende i det nordøstlige Sydamerika, blev det antaget, at parasitten blev bragt derfra til Europa under boom af chilensk saltpeter. Undersøgelser udført på Rockefeller Center kartoffelstation i Toluca Valley i Mexico tvang imidlertid denne opfattelse til at blive revideret (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. I Toluca-dalen har lokale tuberøse kartoffelarter (Solanum demissum, S. bulbocastanum osv.) Forskellige sæt gener til lodret resistens kombineret med et højt niveau af uspecifik resistens, hvilket indikerer en lang co-evolution med parasitten. Sydamerikanske arter, herunder afgrøde kartofler, mangler resistensgener.
2. I Toluca-dalen findes isolater med parringstyperne A1 og A2, hvilket resulterer i, at den indavlede population af P. infestans er udbredt; mens i det oprindelige land med kultiverede kartofler, Sydamerika, spredes parasitten klonalt.
3. I Toluca-dalen er der årlige alvorlige epidemier med sen rødme. Derfor er holdningen om Mesoamerica (Mellemamerika) som fødested for kartoffelfytophthora blandt nordamerikanske forskere (Cornell University) etableret (Goodwin et al., 1994).
Sydamerikanske forskere deler ikke denne opfattelse. De mener, at den dyrkede kartoffel og dens parasit P. infestans har et fælles hjemland - de sydamerikanske Andesbjergene. De støttede deres synspunkt ved molekylære undersøgelser af analysen af DNA-polymorfier i mitokondriegenomet (mtDNA) og nukleare gener RAS og β-tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). De viste, at stammerne indsamlet fra forskellige dele af verden stammer fra tre divergerende forfædre linjer, som (alle tre) findes i de sydamerikanske Andesbjergene. Andes haplotyper er efterkommere af to linjer: isolater af den ældste mtDNA-slægt findes på vilde Solanaceae fra sektionen Anarrhicomenum i Ecuador, mens isolater af anden linje er almindelige på kartofler, tomater og vilde natskygge. I Toluca stammer selv sjældne haplotyper kun fra en afstamning, med den genetiske variabilitet af stammer fra Toluca (lav allelfrekvens på nogle variable steder) antyder en stærk grundlæggereffekt på grund af den nylige drift.
Derudover blev der fundet en ny art P. andina i Andesbjergene, morfologisk og genetisk svarende til P. infestans, som ifølge forfatterne peger på Andesbjergene som et hot spot af speciering i slægten Phytophthora. Endelig inkluderer P. infestans i Europa og USA begge Andes-slægter, mens de kun er i Toluca.
Denne publikation tilskyndede et svar fra en gruppe forskere fra forskellige lande, der gjorde en masse eksperimentelt arbejde for at revidere den tidligere undersøgelse (Goss et al., 2014). I dette arbejde blev der for det første anvendt mere informative mikrosatellit-DNA-sekvenser til at studere DNA-polymorfier; for det andet til analyse af klynger, migrationsstier, tidsdivergens hos befolkninger osv. mere avancerede modeller blev brugt (F-statistik, Bayesiske tilnærmelser osv.), og for det tredje blev der ikke kun brugt en sammenligning med den andinske art P. andina, hvor en hybrid natur blev etableret (P. infestans x Phytophthora sp.) men også med den mexicanske endemiske art P. mirabilis, P. Ipomoeae og Phytophthora phaseoli, som er genetisk tæt P. infestans inkluderet i samme klade (Kroon et al., 2012). Som et resultat af disse analyser blev det utvetydigt vist, at roddelen af det fylogenetiske træ af alle arter af slægten Phytophthora taget med i undersøgelsen, bortset fra hybrid P. andina, tilhører mexicanske stammer, og migrationsstrømmen har retning Mexico - Andes, og ikke omvendt, og dens begyndelse falder sammen med den europæiske kolonisering af den nye verden (300-600 år siden). Således opstod fremkomsten af P. infestans-arten, der var specialiseret til nederlag for kartofler, i det sekundære genetiske centrum for dannelsen af tuberøs solanaceae, dvs. i Mellemamerika.
Genom af P. INFESTANS
I 2009 sekventerede et internationalt team af forskere det komplette P infestans genom (Haas et al, 2009), hvis størrelse var 240 MB. Dette er flere gange mere end hos nært beslægtede arter P. sojae (95 Mb), der forårsager rodrot af sojabønner og P. Ramorum (65 Mb), der påvirker værdifulde træarter som eg, bøg og nogle andre. De opnåede data viste, at genomet indeholder et stort antal kopier af gentagne sekvenser - 74%. Genomet indeholder 17797 proteinkodende gener, hvoraf de fleste er gener involveret i cellulære processer, herunder DNA-replikation, transkription og translation af proteiner.
En sammenligning af genomerne fra slægten Phytophthora afslørede en usædvanlig organisering af genomet, bestående af blokke af sekvenser af konserverede gener, hvor gentætheden er relativt høj, og indholdet af gentagne sekvenser er relativt lav, og individuelle regioner med ikke-konserverede gensekvenser med en lav gentæthed og et højt indhold af gentagne regioner. Konservative blokke tegner sig for 70% (12440) af alle P. infestans proteinkodende gener. Inden for konservative blokke er gener normalt tæt placeret med en gennemsnitlig intergen afstand på 604 bp. I områder mellem konservative blokke er den intergeniske afstand større (3700 bp) på grund af en stigning i tætheden af gentagne elementer. Hurtigt udviklende effektor sekretoriske gener er placeret i genfattige regioner.
Sekvensanalyse af P. Infestans genomet viste, at ca. en tredjedel af genomet tilhører transponerbare elementer. Genomet af P. infestans indeholder signifikant flere forskellige transposonerfamilier end andre kendte genomer. De fleste af P. infestans transposoner tilhører sigøjnerfamilien.
I genomet af P. infestans er der identificeret et stort antal specifikke genfamilier involveret i patogenese. En væsentlig del af dem koder for effektorproteiner, der ændrer værtsplantens fysiologi og bidrager til dens infektion. De hører til to brede kategorier: apoplastiske effektorer, der virker i de intercellulære rum (apoplaster) og cytoplasmiske effektorer, der kommer ind i celler via haustoria. Apoplastiske effektorer inkluderer secernerede hydrolytiske enzymer, såsom proteaser, lipaser og glycosylaser, der ødelægger planteceller; hæmmere af værtsplanteforsvarsenzymer og nekrotiserende toksiner såsom Nep1-lignende proteiner (NPL'er) og Pcf-lignende små cysteinrige proteiner (SCR'er).
P. infestans-effektorgener er talrige og normalt større end ikke-patogene gener. De mest berømte er de cytoplasmatiske effektorer RXLR og Crinkler (CNR). De typiske cytoplasmatiske effektorer af oomycetes er RXLR-proteiner. Alle hidtil opdagede RXLR-effektorgener indeholder den aminoterminalgruppe Arg-XLeu-Arg, hvor X er en aminosyre. Som et resultat af undersøgelsen blev det foreslået, at der er 563 RXLR-gener i P. infestans-genomet, hvilket er 60% mere end i P. sojae og P. ramorum. Cirka halvdelen af RXLR-generne i P. infestans genomet er artsspecifik. RXLR-effektorer har en lang række sekvenser. Blandt dem blev der identificeret en stor og 150 små familier. I modsætning til hovedproteomet er RXLR-effektorgenerne normalt placeret i genfattige og gentagne rige regioner i genomet. De mobile elementer, der bestemmer dynamikken i disse regioner, letter rekombination i disse gener.
Cytoplasmatiske CRN-effektorer blev oprindeligt identificeret i P. infestans-transkripter, der koder plantevævsnekrose-peptider. Siden deres opdagelse har der været lidt kendt om familien til disse effektorer. Analyse af P. Infestans genomet afslørede en enorm familie på 196 CRN gener, som er meget større end P. sojae (100 CRN) og P. ramorum (19 CRN). Ligesom RXLR'er er CRN'er modulære proteiner og består af et stærkt konserveret N-terminalt LFLAK-domæne (50 aminosyrer) og et tilstødende DWL-domæne indeholdende forskellige gener. De fleste CRN'er (60%) har et signalpeptid.
Muligheden for forskellige CRN'er til at forstyrre værtsplantens cellulære processer er blevet undersøgt. Ved analysen af plantennekrose gjorde fjernelsen af CRN2-proteiner det muligt at identificere den C-terminale region bestående af 234 aminosyrer (position 173-407, DXG-domæne) og forårsage celledød. Analyse af P. infestans CRN-gener afslørede fire forskellige C-terminale regioner, som også forårsager celledød i planten. Disse inkluderer de nyligt identificerede DC-domæner (P. Infestans har 18 gener og 49 pseudogener) samt D2 (14 og 43) og DBF (2 og 1) domæner, der ligner proteinkinaser. Proteiner fra CRN-domæner udtrykt i en plante konserveres (i fravær af signalpeptider) i en plantecelle og stimulerer celledød ved en intracellulær mekanisme. Yderligere 255 sekvenser indeholdende CRN-domæner fungerer sandsynligvis ikke som gener.
Stigningen i antallet og størrelsen af RXLR- og CRN-effektorgenfamilierne var sandsynligvis på grund af ikke-allel homolog rekombination og genduplikation. På trods af at genomet indeholder et stort antal aktive mobile elementer, er der stadig ingen direkte beviser for overførsel af effektorgener.
Metoder anvendt i undersøgelsen af befolkningsstruktur
Undersøgelsen af befolkningens genetiske struktur er i øjeblikket baseret på analysen af rene kulturer af dets bestanddele. Analysen af populationer uden isolering af rene kulturer udføres også til specifikke formål, såsom for eksempel at studere aggressiviteten af en befolkning eller tilstedeværelsen af stammer, der er resistente over for fungicider i den (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Denne type forskning indebærer anvendelse af specielle metoder, hvis beskrivelse ligger uden for denne gennemgang. Til den komparative analyse af stammer anvendes en række metoder, der er baseret både på analysen af DNA-strukturen og på studiet af fænotypiske manifestationer. Sammenligningsanalyse af populationer har at gøre med et stort antal isolater, hvilket stiller visse krav til de anvendte metoder. Ideelt set skal de opfylde følgende krav (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- være billig, nem at implementere, ikke kræve betydelige tidsforbrug, være baseret på almindeligt tilgængelige teknologier (for eksempel PCR)
- skal generere et tilstrækkeligt stort antal uafhængige kodominant markørfunktioner;
- har høj reproducerbarhed
- brug den mindste mængde væv, der skal undersøges
- være specifik for substratet (forureningen til stede i kulturen bør ikke påvirke resultaterne)
- kræver ikke brug af farlige procedurer og meget giftige kemikalier.
Desværre er der ingen metoder, der svarer til alle ovenstående parametre. Til en sammenlignende undersøgelse af stammer i vores tid anvendes metoder baseret på analyse af fænotypiske træk: virulens over for kartoffel- og tomatvarianter (kartoffel- og tomatløb), parringstype, spektre af peptidase-isoenzymer og glucose-6-fosfatisomerase og på analyse af DNA-struktur: længde polymorfisme restriktionsfragment (RFLP), som sædvanligvis suppleres med en hybridiseringsprobe RG 57, analyse af mikrosatellit-gentagelser (SSR og InterSSR), amplifikation med tilfældige primere (RAPD), amplifikation af restriktionsfragmenter (AFLP), amplifikation med primere homologe med sekvenserne af mobile elementer (for eksempel Inter SINE PCR), bestemmelse af mitokondrie-DNA-haplotyper.
Korte beskrivelser af metoder til sammenlignende undersøgelse af stammer anvendt i arbejde med P. Infestans
Fænotypiske markørtræk
"Kartoffel" løb
"Kartoffel" løb er en almindeligt undersøgt og brugt markør. "Enkle kartoffel" -løb har et gen til kartoffelvirulens, "komplekse" - mindst to. Black et al. (1953), der opsummerer alle de tilgængelige data for dem, fandt, at phytophthora-racen er i stand til at inficere planter med resistensgenet / -genene svarende til P. infestans virulensgenet / -genene og fandt race 1, 2, 3 og 4, der inficerer planter med henholdsvis generne R1, R2, R3 og R4, dvs. interaktionen mellem parasitten og værten sker i overensstemmelse med genet for gen-princippet. Endvidere opdagede Black med deltagelse af Gallegly og Malcolmson resistensgenerne R5, R6, R7, R8, R9, R10 og R11 samt de tilsvarende racer (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Der er en omfattende mængde data om racemæssig sammensætning af patogenet fra forskellige regioner. Uden at analysere disse data detaljeret vil vi kun angive en generel tendens: hvor sorter med nye resistensgener eller deres kombinationer blev brugt, var der først en vis svækkelse af sen rødme, men derefter dukkede løb med de tilsvarende virulensgener op og blev valgt, og udbrud af sen rødme genoptog. Specifik virulens mod de første 4 resistensgener (R1-R4) blev sjældent observeret i de samlinger, der blev indsamlet før introduktionen til dyrkning af sorter med disse gener, men antallet af virulente stammer steg kraftigt, når patogenet blev parasitiseret på sorter, der bar disse gener. Gener 5-11 var derimod ret almindelige i samlinger (Shaw, 1991).
En undersøgelse af forholdet mellem forskellige racer i vækstsæsonen, der blev udført i slutningen af 1980'erne, viste at kloner med lav aggressivitet og 1-2 virulensgener i begyndelsen af sygdommens udvikling dominerede i befolkningen.
Desuden falder koncentrationen af de originale kloner med udviklingen af sen rødme, og antallet af "komplekse" løb med høj aggressivitet øges. Forekomsten af sidstnævnte ved slutningen af sæsonen når 100%. Ved opbevaring af knolde er der et fald i aggressivitet og tab af individuelle virulensgener. Dynamikken ved klonudskiftning kan forekomme i forskellige sorter på forskellige måder (Rybakova & Dyakov, 1990). Imidlertid viste vores undersøgelser i 2000-2010, at komplekse racer findes lige fra begyndelsen af epifytotika blandt stammer isoleret fra både kartofler og tomater. Dette skyldes sandsynligvis ændringer i befolkningen af P. Infestans i Rusland.
I 1988-1995 nåede hyppigheden af "superraces" med alle eller næsten alle virulensgener i forskellige regioner op på 70-100%. En sådan situation blev for eksempel bemærket i Hviderusland, i Leningrad, Moskva-regionerne, i Nordossetien og i Tyskland (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomat" løb
I tomatkulturer blev der kun fundet 2 gener med resistens over for sen rødme - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) og Ph2 (Al-Kherb, 1988). Som i tilfældet med kartoffelløb sker interaktionen mellem tomater og P. infestans på gen-for-gen-basis. T0-løbet inficerer sorter, der ikke har resistensgener (de fleste af de industrielt anvendte sorter), T1-racen inficerer sorter med Ph1-genet (Ottawa), og T2-løbet inficerer sorter med Ph2-genet.
I Rusland blev næsten udelukkende T0 fundet på kartofler; T0 dominerede på tomater i begyndelsen af sæsonen, men senere blev den erstattet af T1 løbet (Dyakov et al., 1975, 1994). Efter 2000 begyndte T1 på kartofler i mange populationer at forekomme i begyndelsen af den epifytotiske periode. I USA var kartoffelstammer ikke-patogene for tomat såvel som løb T0, T1 og T2, mens T1 og T2 dominerede på tomater (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Parringstype
For at gennemføre undersøgelsen kræves test (stempel) stammer med kendte parringstyper - A1 og A2. Testisolatet inokuleres med dem parvis i petriskåle med havreagarmedium. Efter inkubation i 10 dage undersøges pladerne for tilstedeværelse eller fravær af oosporer i mediet i stammernes kontaktzone. Der er fire muligheder: stammen tilhører A4-parringstypen, hvis den danner oosporer med A1-testeren, til A2, hvis den danner oosporer med A2-testeren, til A1A1, hvis den danner oosporer med begge testere, eller er steril (2), hvis den ikke danner oosporer uden testere (de sidste to grupper er sjældne).
For hurtigere at bestemme parringstyperne blev der gjort forsøg på at identificere regioner i genomet, der er forbundet med parringstypen, med det formål at anvende dem yderligere til at bestemme typen af parring ved PCR. Et af de første vellykkede eksperimenter til at identificere et sådant sted blev udført af amerikanske forskere (Judelson et al., 1995). Ved hjælp af RAPD-metoden var de i stand til at identificere W16-regionen associeret med parringstype i afkom fra de to krydsede isolater og designe et par 24-bp-primere til dets forstærkning (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') og W16-2 (5 -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Efter restriktion af PCR-produktet med restriktionsenzym HaeIII var det muligt at adskille isolater med parringstyperne A1 og A2.
Et andet forsøg på at få PCR-markører til at bestemme typerne af parring blev foretaget af koreanske forskere (Kim, Lee, 2002). De identificerede specifikke produkter ved hjælp af AFLP-metoden. Som et resultat blev et par primere PHYB-1 (fremad) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') og PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') udviklet, hvilket tillod selektiv amplifikation af genomområdet associeret med A2-parringstype. Derefter fortsatte de dette arbejde og designet primere 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, fremad) og 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), hvilket muliggør selektiv forstærkning af Mat-A1-regionen karakteristisk for stammer med parringstype A1. Brugen af PCR-diagnostik af parringstyper viste gode resultater, når man studerede populationer af P. infestans i Tjekkiet (Mazakova et al., 2006), Tunesien (Jmour, Hamada, 2006) og andre regioner. I vores laboratorium (Mytsa, Elansky, upubliceret) blev 34 P. infestans stammer isoleret fra syge kartoffel- og tomatorganer i forskellige regioner i Rusland (Kostroma, Ryazan, Astrakhan og Moskva) analyseret. Resultaterne af PCR-analyse under anvendelse af specifikke primere mere end 90% faldt sammen med resultaterne af analysen af parringstypen ved den traditionelle metode på et næringsmedium.
Tabel 1. Variabilitet i resistens inden for Sib 1-klonen (Elansky et al., 2001)
Prøveopsamlingssted | Antal analyserede analyser | Antal følsomme (S), svagt resistente (SR) og resistente (R) stammer, stk (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburg by | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk-regionen | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylresistens som populationsmarkør
I begyndelsen af 1980'erne blev der konstateret kraftige udbrud af sen rødme forårsaget af metalaxyl-resistente P. infestans stammer i forskellige regioner. Kartoffelbedrifter i mange lande har lidt betydelige tab (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Siden da er der i mange lande i verden foretaget konstant overvågning af forekomsten af phenylamidresistente stammer i P. infestans-populationer. Ud over en praktisk vurdering af udsigterne til brug af phenylamidholdige lægemidler, opbygning af et system med beskyttelsesforanstaltninger og forudsigelse af epytofotier er resistens over for disse lægemidler blevet en af markørfunktionerne, der er meget anvendt til komparativ analyse af populationer af dette patogen. Anvendelsen af resistens over for metalaxyl i sammenlignende befolkningsundersøgelser skal dog udføres under hensyntagen til det faktum, at: 1 - det genetiske grundlag for resistens endnu ikke er bestemt nøjagtigt, 2 - resistens over for metalaxyl er et selektivt afhængigt træk, der kan ændre sig afhængigt af anvendelsen af phenylamider, 3 - forskellige graden af følsomhed over for metalaxylstammer inden for en klonal linje (tabel 1).
Spektre af isozymer
Isozymmarkører er normalt uafhængige af ydre forhold, viser mendelsk arv og er kodominante, hvilket gør det muligt at skelne mellem homo- og heterozygoter. Anvendelsen af proteiner som genmarkører gør det muligt at identificere både store omorganiseringer af det genetiske materiale, herunder kromosomale og genomiske mutationer, og enkelte aminosyresubstitutioner.
Elektroforetiske undersøgelser af proteiner har vist, at de fleste enzymer findes i organismer i form af flere fraktioner, der adskiller sig i elektroforetisk mobilitet. Disse fraktioner er resultatet af kodning af flere former for enzymer ved forskellige loci (isozymer eller isozymer) eller ved forskellige alleler på samme sted (allozymer eller alloenzymer). Det vil sige, isozymer er forskellige former for et enzym. Forskellige former har den samme katalytiske aktivitet, men adskiller sig lidt i enkelte aminosyresubstitutioner i peptidet og med ansvar. Sådanne forskelle afsløres under elektroforese.
Når man studerer P. infestans-stammer, anvendes spektrene af isoenzymer af to proteiner, peptidase og glucose-6-phosphat-isomerase (dette enzym er monomorf i russiske populationer, derfor er metoder til dets undersøgelse ikke præsenteret i dette arbejde). For at adskille dem i isozymer i et elektrisk felt påføres proteinpræparater isoleret fra de undersøgte organismer på en gelplade anbragt i et elektrisk felt. Diffusionshastigheden af individuelle proteiner i gelen afhænger af ladningen og molekylvægten; derfor, i et elektrisk felt, separeres blandingen af proteiner i separate fraktioner, som kan visualiseres ved hjælp af specielle farvestoffer.
Undersøgelsen af peptidase-isoenzymer udføres på celluloseacetat-, stivelses- eller polyacrylamidgeler. Den mest bekvemme er metoden baseret på anvendelsen af celluloseacetatgeler fremstillet af Helena Laboratories Inc. Det kræver ikke store mængder testmaterialer, det giver en mulighed for at opnå kontrasterende bånd på gelen efter elektroforese for begge enzymlokationer, dets implementering kræver ikke store tids- og materialomkostninger (fig. 2).
Et lille stykke mycelium overføres til en 1,5 ml mikrorør, der tilsættes 1-2 dråber destilleret vand til den. Derefter homogeniseres prøven (for eksempel med en elektrisk boremaskine med en plastikfastgørelse, der er egnet til en mikrorør) og sedimenteres i 25 sekunder på en centrifuge ved 13000 omdr./min. 8 pi fra hver mikrorør. supernatanten overføres til applikatorpladen.
Celluloseacetatgelen fjernes fra bufferbeholderen, blottes mellem to ark filterpapir og placeres med arbejdslaget oven på applikatorens plastbase. Opløsningen fra pladen overføres af applikatoren til gelen 2-4 gange. Gelen overføres til et elektroforesekammer,
Tabel 2. Sammensætningen af opløsningen anvendt til farvning af celluloseacetatgel ved analysen af peptidase-isoenzymer, en dråbe maling (bromphenolblå) anbringes på kanten af gelen.
TRIS HCI, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidase, 1000 E / ml 5 dråber
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 dråber
MgCl2, 20 mg / ml 2 dråber
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 dråber
L-aminosyreoxidase, 20 u / ml 2 dråber
Elektroforese udføres i 20 minutter. ved 200 V. Efter elektroforese overføres gelen til et maleribord og males med en speciel maleropløsning (tabel 2). 10 ml 1,6% DIFCO-agar smeltes indledningsvis i en mikrobølgeovn, afkøles til 60 ° C, hvorefter 2 ml agar blandes med en malingsblanding og hældes på gelen. Striber vises inden for 15-20 minutter. L-aminosyreoxidasereagenset tilsættes umiddelbart før blandingen af opløsningen med smeltet agar.
I russiske populationer er Pep 1-locus repræsenteret af genotyper 100/100 og 92/100. Homozygote 92/92 er ekstremt sjælden (ca. 0,1%). Locus Rehr 2 er repræsenteret af tre genotyper 100/100, 100/112 og 112/112, og alle 3 varianter er ret almindelige (Elanky og Smirnov, 2003, fig. 2).
Genomforskning
Restriktionsfragmentlængde polymorfisme med efterfølgende hybridisering (RFLP-RG 57)
Det samlede DNA behandles med Eco R1-restriktionsenzym, DNA-fragmenterne adskilles ved elektroforese i agarosegel. Nukleart DNA er meget stort og har mange gentagne sekvenser, hvilket gør det vanskeligt direkte at analysere de talrige fragmenter, der opnås ved hjælp af restriktionsenzymer. Derfor overføres DNA-fragmenterne, der er adskilt i gelen, til en speciel membran og anvendes til hybridisering med RG 57-sonden, som inkluderer nukleotider mærket med radioaktive eller fluorescerende mærker. Denne probe hybridiserer med gentagne genomiske sekvenser (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Efter visualisering af resultaterne af hybridisering på et lys- eller radioaktivt materiale opnås en multi-locus hybridiseringsprofil (fingeraftryk) repræsenteret af 25-29 fragmenter (Forbes et al., 1998). Aseksuelle (klonale) afkom vil have de samme profiler. Arrangementet af båndene på elektroforetogrammet bruges til at bedømme ligheder og forskelle mellem de sammenlignede organismer.
Mitokondrie DNA-haplotyper
I de fleste eukaryote celler præsenteres mtDNA i form af et dobbeltstrenget cirkulært DNA-molekyle, som i modsætning til de nukleare kromosomer i eukaryote celler replikerer semi-konservativt og ikke er forbundet med proteinmolekyler.
P. infestans mitokondrielle genom blev sekventeret, og et antal værker blev viet til analysen af restriktionsfragmentlængder (Carter et al., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Efter at Griffith og Shaw (1998) udviklede en enkel og hurtig metode til bestemmelse af mtDNA-haplotyper, blev denne markør en af de mest populære i P. Infestans-studier. Essensen af metoden består i sekventiel amplifikation af to mitokondrie-DNA-fragmenter (fra det fælles genom) med primere F2-R2 og F4-R4 (tabel 3) og deres efterfølgende restriktion med restriktionsenzymer MspI (1. fragment) og EcoR1 (2. fragment). Metoden giver dig mulighed for at identificere 4 haplotyper: Ia, IIa, Ib, IIb. Type II adskiller sig fra type I ved tilstedeværelsen af et insert 1881 bp i størrelse og ved en anden placering af restriktionssteder i regionerne P2 og P4 (fig. 3).
Siden 1996 blev der blandt de stammer, der blev indsamlet på Ruslands territorium, kun noteret haplotyper Ia og IIa (Elansky et al., 2001, 2015). De kan identificeres efter adskillelse af restriktionsprodukterne med primer F2-R2 i et elektrisk felt (fig. 4, 5). Typer af mtDNA anvendes i komparativ analyse af stammer og populationer. I en række værker blev typer af mitokondrie-DNA brugt til at isolere kloniske linjer og passere P. infestans-isolater (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Ved hjælp af PCR-RFLP-metoden blev det konkluderet, at mtDNA er heterogent i den samme P. infestans-stamme (Elansky og Milyutina, 2007). Forstærkningsbetingelser: 1x (500 sek. 94 ° C), 40 x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaktionsblanding: (20 pi): 0,2 U Taq DNA-polymerase, 1 x 2,5 mM MgCl2-Taq-buffer, 0,2 mM hver dNTP, 30 pM primer og 5 ng af det analyserede DNA, deioniseret vand - op til 20 pi.
Begrænsning af PCR-produktet udføres i 4-6 timer ved en temperatur på 37 ° C. Restriktionsblanding (20 pi): 10x MspI (2 pi), 10x restriktionsbuffer (2 pi), deioniseret vand (6 pi), PCR-produkt (10 pi).
Tabel 3. Primere anvendt til amplifikation af polymorfe mtDNA-regioner
Locus | primer | Primerlængde og placering | PCR-produktlængde | Begrænsning |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Random primer amplification (RAPD)
Ved udførelse af RAPD anvendes en primer (undertiden flere primere samtidigt) med en vilkårlig nukleotidsekvens, normalt 10 nukleotider i længden, med et højt indhold (fra 50%) af GC-nukleotider og en lav udglødningstemperatur (ca. 35 ° C). Sådanne primere "lander" på adskillige komplementære steder i genomet. Efter amplifikation opnås et stort antal amplikoner. Deres antal afhænger af den eller de anvendte primere og reaktionsbetingelserne (MgCl2-koncentration og udglødningstemperatur).
Visualisering af amplikoner udføres ved destillation i polyacrylamid eller agarosegel. Når du udfører RAPD-analyse, er det nødvendigt nøje at overvåge renheden af det analyserede materiale, fordi forurening med andre levende genstande kan forårsage en signifikant stigning i antallet af artefakter, som er ret mange selv i analysen af rent materiale (Perez et al, 1998). Anvendelsen af denne metode i studiet af P. infestans genomet afspejles i mange værker (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Valget af reaktionsbetingelser og primere (51 10-nukleotidprimere blev undersøgt) er givet i artiklen af Abu-El Samen et al., (2003).
Microsatellite Repeat Analysis (SSR)
Mikrosatellit-gentagelser (simple sekvens-gentagelser, SSR) er gentagne gange gentagne korte sekvenser på 1-3 (undertiden op til 6) nukleotider til stede i de nukleare genomer af alle eukaryoter. Antallet af successive gentagelser kan variere fra 10 til 100. Microsatellite loci forekommer med en forholdsvis høj frekvens og er mere eller mindre jævnt fordelt i hele genomet (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfisme af mikrosatellitsekvenser er forbundet med forskelle i antallet af gentagelser af det grundlæggende motiv. Mikrosatellitmarkører er kodominante, hvilket gør det muligt at bruge dem til at analysere befolkningsstrukturen, bestemme slægtskab, genotype-migrationsstier osv. Blandt andre fordele ved disse markører skal man bemærke deres høje polymorfisme, god reproducerbarhed, neutralitet og evnen til at udføre automatisk analyse og evaluering Analyse af polymorfisme af mikrosatellit-gentagelser udføres ved PCR-amplifikation ved anvendelse af primere komplementære til unikke sekvenser flankerende mikrosatellit loci. Oprindeligt blev analysen udført med adskillelsen af reaktionsprodukterne på en polyacrylamidgel. Senere foreslog medarbejderne i virksomheden Applied Biosystems at bruge fluorescerende mærkede primere til påvisning af reaktionsprodukter ved hjælp af en automatisk laserdetektor (Diehl et al., 1990) og derefter standard automatiske DNA-sequencere (Ziegle et al., 1992). Mærkning af primere med forskellige fluorescerende farvestoffer gør det muligt at analysere flere markører på én gang og dermed væsentligt øge produktiviteten af metoden og øge nøjagtigheden af analysen.
De første publikationer viet til brugen af SSR-analyse til undersøgelsen af P. infestans dukkede op i begyndelsen af 2000'erne. (Knapova, Gisi, 2002). Ikke alle markører, der blev foreslået af forfatterne, viste en tilstrækkelig grad af polymorfisme, men to af dem (4B og G11) blev inkluderet i det sæt af 12 SSR-markører, der blev foreslået af Lees et al. (2006) og derefter blev vedtaget i forskningsnetværket Eucablight (www.eucablight .org) som standard for P. infestans. Et par år senere blev en undersøgelse offentliggjort om oprettelsen af et system til multiplexanalyse af P. infestans DNA baseret på otte SSR-markører (Li et al., 2010). Endelig, efter at have evalueret alle tidligere foreslåede markører og valgt den mest informative af dem samt optimering af primere, fluorescerende mærker og amplifikationsbetingelser, præsenterede den samme gruppe forfattere et system med en-trins multiplexanalyse, inklusive 12 markører (tabel 4; Li et al. , 2013a). Primerne anvendt i dette system blev valgt og mærket med en af fire fluorescerende markører (FAM, VIC, NED, PET), således at intervallerne for allelstørrelser af primere med de samme mærker ikke overlappede.
Forfatterne udførte analysen på en PTC200 forstærker (MJ Research, USA) ved hjælp af QIAGEN multiplex PCR-sæt eller QIAGEN Typeit Microsatellite PCR-sæt. Volumenet af reaktionsblandingen var 12.5 μL. Amplifikationsbetingelserne var som følger: for QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (60 sek), 72 ° C (20 min); til QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (20 sek), 60 ° C (30 min).
Adskillelse og visualisering af PCR-produkter blev udført ved anvendelse af en ABI3730 automatisk kapillær DNA-analysator (Applied Biosystems).
Tabel 4. Karakteristika for 12 standard SSR-markører anvendt til genotypebestemmelse P. Infestans (Li et al., 2013a)
Navn | Antal alleler | Størrelsesområde alleler (bp) | Primere |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
PI02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACAACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
PI04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
PI70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
PI63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Et eksempel på visualisering af analyseresultaterne er vist i fig. 6. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af GeneMapper 3.7 software ved at sammenligne de opnåede data med dataene fra kendte isolater. For at lette fortolkningen af analyseresultaterne er det nødvendigt at inkludere 1-2 referenceisolater med en kendt genotype i hver undersøgelse.
Den foreslåede forskningsmetode blev testet på et betydeligt antal feltprøver, hvorefter forfatterne udførte standardisering af protokoller mellem laboratorier fra to organisationer, The James Hutton Institute (UK) og Wageningen University & Research (Holland), som sammen med muligheden for at bruge standard FTA-kort til forenklet indsamling og forsendelse af P. infestans DNA-prøver, gjorde det muligt at tale om muligheden for kommerciel brug af denne udvikling. Derudover gjorde en hurtig og nøjagtig metode til genotypebestemmelse af P. infestans isolater ved hjælp af multiplex SSR-analyse det muligt at gennemføre standardiserede undersøgelser af populationer af dette patogen på global skala og oprettelse af en verdensdatabase om sen rødme inden for rammerne af Eucablight-projektet (www.eucablight.org), herunder , inklusive resultaterne af mikrosatellitanalyse, gjorde det muligt at spore fremkomsten og spredningen af nye genotyper rundt om i verden.
Amplificeret restriktionsfragmentlængde polymorfisme (AFLP). AFLP (amplificeret fragmentlængde polymorfisme) er en teknologi til generering af tilfældige molekylære markører ved anvendelse af specifikke primere. I AFLP behandles DNA med en kombination af to restriktionsenzymer. Specifikke adaptere ligeres til de klæbrige ender af restriktionsfragmenterne.
Disse fragmenter amplificeres derefter ved anvendelse af primere, der er komplementære til adaptorsekvensen og restriktionsstedet og derudover bærer en eller flere tilfældige baser i deres 3'-ender. Sættet af opnåede fragmenter afhænger af restriktionsenzymer og tilfældigt udvalgte nukleotider i 3'-enderne af primerne (Vos et al., 1995). AFLP - genotypebestemmelse bruges til hurtigt at undersøge den genetiske variation af forskellige organismer.
En detaljeret beskrivelse af metoden findes i Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Meget arbejde med at sammenligne opløsningen af AFLP- og SSR-metoder er blevet udført af kinesiske forskere. De fænotypiske og genotypiske egenskaber ved 48 P. infestans isolater opsamlet fra fem regioner i Nordkina blev undersøgt. AFLP-spektrene afslørede otte forskellige DNA-genotyper i modsætning til SSR-genotyperne, for hvilke der ikke blev fundet mangfoldighed (Guo et al., 2008).
Amplifikation med primere homologe med sekvenserne af mobile elementer
Markører afledt af sekvenser af retrotransposoner er meget praktiske til genetisk kortlægning, undersøgelse af genetisk mangfoldighed og evolutionære processer (Schulman, 2006). Hvis primere er lavet til at supplere de stabile sekvenser af visse mobile elementer, er det muligt at amplificere regionerne i genomet, der er placeret mellem dem. I studier af det forårsagende middel til sen rødme blev metoden til amplifikation af dele af genomet ved hjælp af en primer komplementær til kernesekvensen af SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) retropazon anvendt med succes (Lavrova og Elansky, 2003). Ved hjælp af denne metode blev forskelle afsløret selv i aseksuelt afkom af et isolat. I den henseende blev det konkluderet, at inter-SINE-PCR-metoden er meget specifik, og bevægelseshastigheden for SINE-elementer i Phytophthora-genomet er høj.
I P. infestans genom er der identificeret 12 familier med korte retrotransposoner (SINE'er); artsfordelingen af korte retrotransposoner blev undersøgt; elementer (SINE'er), der findes i genomet af kun P. infestans, blev afsløret (Lavrova, 2004).
Funktioner ved anvendelsen af metoder til sammenlignende undersøgelse af stammer i befolkningsundersøgelser
Når du planlægger en undersøgelse, er det nødvendigt at forstå de mål, den forfølger, og bruge de relevante metoder. Således gør nogle metoder det muligt at generere et stort antal uafhængige markørtegn, men har samtidig lav reproducerbarhed og afhænger stærkt af de anvendte reagenser, reaktionsbetingelser og forureningen af testmaterialet. Derfor er det i hver undersøgelse af en gruppe stammer nødvendigt at bruge flere standardisolater (reference), men selv i dette tilfælde er resultaterne af flere eksperimenter meget vanskelige at kombinere.
Denne gruppe af metoder inkluderer RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Efter amplifikation opnås et stort antal DNA-fragmenter i forskellige størrelser. Det tilrådes at anvende sådanne teknikker, hvis det er nødvendigt at etablere forskelle mellem tæt beslægtede stammer (forælder-afkom, vildtypemutanter osv.) Eller i tilfælde, hvor der kræves en detaljeret analyse af en lille prøve. AFLP-metoden anvendes således i vid udstrækning til genetisk kortlægning af P. infestans (van der Lee et al., 1997) og i intrapopulationsundersøgelser (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al., 2003, Flier et al, 2003). Sådanne metoder er upassende at bruge, når der oprettes databaser over stammer, fordi det er praktisk taget umuligt at samle regnskab for resultater, når man udfører analyser i forskellige laboratorier.
På trods af den tilsyneladende enkelhed og hurtig udførelse (DNA-isolering uden god oprensning, amplifikation, visualisering af resultaterne) kræver denne gruppe af metoder anvendelse af en særlig metode til dokumentation af resultaterne: destillation i polyacrylamidgel med mærkede (radioaktive eller lysende) primere og efterfølgende eksponering for lys eller radioaktivt materiale. Konventionel billeddannelse af ethidiumbromidagarosegel er generelt ikke egnet til disse metoder, fordi et stort antal DNA-fragmenter i forskellige størrelser kan smelte sammen.
Andre metoder tværtimod gør det muligt at generere et lille antal funktioner med deres meget høje reproducerbarhed. Denne gruppe inkluderer undersøgelse af mitokondrie-DNA-haplotyper (kun to haplotyper Ia og IIa er noteret i Rusland), parringstype (de fleste isolater er opdelt i 2 typer: A1 og A2, selvfrugtbar SF findes sjældent) og peptidase-isozymspektre (to loci Pep1 og Pep2 , der består af to isozymer hver) og glucose-6-fosfatisomerase (i Rusland er der ingen variation i dette træk, skønt signifikant polymorfisme bemærkes i andre lande i verden). Det tilrådes at bruge disse funktioner til analyse af samlinger, kompilering af regionale og globale databaser. I tilfælde af analyse af isozymer og haplotyper af mitokondrie-DNA er det overhovedet muligt at undvære standardstammer, mens der i analysen af parringstyper kræves to testisolater med kendte parringstyper.
Reaktionsbetingelser og reagenser kan kun påvirke produktets kontrast på elektroforetogrammet; manifestationen af artefakter i denne type undersøgelser er usandsynlig.
I øjeblikket er størstedelen af befolkningerne i den europæiske del af Rusland repræsenteret af stammer af begge parringstyper (tabel 6), blandt dem er der isolater med typerne Ia og IIa af mitokondrie-DNA (andre typer mtDNA fundet i verden blev ikke fundet i Rusland efter 1993). Spektrene for peptidase-isozymer er repræsenteret af to genotyper på Pep1-locus (100/100, 92/92 og heterozygote 92/100, og 92/92-genotypen er ekstremt sjælden (<0,3%)) og to genotyper på Pep 2-locus (100/100 , 112/112 og heterozygote 100/112, hvor genotypen 112/112 forekommer sjældnere end 100/100, men også ganske ofte).
Der var ingen variation i spektret af isoenzymer af glucose-6-phosphat-isomerase efter 1993 (forsvinden af den klonale linje US-1); alle undersøgte isolater havde 100/100-genotypen (Elansky og Smirnov, 2002).
Den tredje gruppe af metoder tillader opnåelse af en tilstrækkelig gruppe af uafhængige markørfunktioner med høj reproducerbarhed. I dag inkluderer denne gruppe RFLP-RG57-proben, der producerer 25-29 DNA-fragmenter i forskellige størrelser. RFLP-RG57 kan bruges både til analyse af prøver og kompilering af databaser. Denne metode er imidlertid meget dyrere end de foregående, den er tidskrævende og kræver en tilstrækkelig stor mængde stærkt oprenset DNA. Derfor er forskeren tvunget til at begrænse volumenet af det testede materiale.
Udviklingen af RFLP-RG57 i begyndelsen af 90'erne i sidste århundrede intensiverede befolkningsundersøgelser af det forårsagende middel til sen rødme betydeligt. Det blev grundlaget for metoden baseret på udvælgelse og analyse af "klonale linjer" (se nedenfor). Sammen med RFLP-RG57 anvendes parringstype, DNA-fingeraftryk (RFLP-RG57-metode), spektre af peptidase og glucose-6-phosphatisomerase-isoenzymer og mitokondrie-DNA-type til at identificere klonale linjer. Takket være ham blev det vist al., 1994), udskiftning af gamle befolkninger med nye (Drenth et al., 1993, Sujkowski et al., 1994, Goodwin et al., 1995a) og klonlinier, der hersker i mange lande i verden, blev identificeret. Undersøgelser af russiske stammer ved hjælp af denne metode viste en høj genotypisk polymorfisme af stammerne af den europæiske del og monomorfisme af befolkningerne i de asiatiske og fjernøstlige dele af Rusland (Elansky et al, 2001). Og nu er denne metode stadig den vigtigste i befolkningsundersøgelser af P. infestans. Imidlertid hindres dens brede fordeling af dens ret høje omkostninger og arbejdskraftintensitet i udførelsen.
En anden lovende teknik, der sjældent bruges i P. infestans-studier, er microsatellite repeat (SSR) analyse. I øjeblikket er denne metode meget brugt til at isolere klonale linjer. Til analyse af stammer blev sådanne fænotypiske markørtræk som tilstedeværelsen af virulensgener til kartoffelsorter (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) og tomat meget udbredt (og bliver fortsat brugt). På nuværende tidspunkt har virulensgener til kartoffelsorter mistet deres værdi som markørtræk for populationsundersøgelser på grund af udseendet af det maksimale (eller tæt på det) antal virulensgener i langt størstedelen af isolater. På samme tid bruges T1-virulensgenet til tomatkulturer, der bærer det tilsvarende Ph1-gen, stadig med succes som et markørtræk (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
I mange værker anvendes resistens over for fungicider som markørtræk. Dette træk er uønsket at anvende i populationsundersøgelser på grund af det ret let udseende af resistensmutationer i klonlinier efter påføring af metalaxyl- (eller mefenoxam-) indeholdende fungicider i marken. For eksempel blev der vist signifikante forskelle i resistensniveauet inden for Sib1-klonlinien (Elansky et al., 2001).
Parringstype, peptidase-isoenzymspektrum, mitokondrie-DNA-type, RFLP-RG57, SSR er således de foretrukne markørfunktioner til oprettelse af databanker og mærkning af stammer i samlinger. For at sammenligne begrænsede prøver, hvis det er nødvendigt at anvende det maksimale antal markørfunktioner, kan du bruge AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (tabel 5). Det skal dog huskes, at disse metoder er dårligt reproducerbare, og i hvert enkelt eksperiment (amplifikationselektroforesecyklus) er det nødvendigt at bruge flere referenceisolater.
Tabel 5. Sammenligning af forskellige forskningsmetoder for stammer P. infestans
kriterium | TC | Isofer-betjente | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Mængde af information | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducerbarhed | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Mulighed for artefakter | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Omkostninger | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Arbejdskraftintensitet | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analysehastighed ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Bemærk: H - lav, C - medium, B - høj; НС * - arbejdsintensiteten er lav, når du bruger agarosegel eller automatisk
genotyper, medium - ved destillation i polyacrylamidgel med mærkede primere,
** - ikke medregnet den tid, der er brugt på dyrkning af mycelium til DNA-isolering.
Befolkningsstruktur
Klonale linjer
I mangel af rekombination eller dets ubetydelige bidrag til befolkningsstrukturen består befolkningen af et bestemt antal kloner, hvis genetiske udveksling er yderst sjælden.
I sådanne populationer er det mere informativt at undersøge ikke frekvenserne for individuelle gener, men frekvenserne af genotyper, der har en fælles oprindelse (klonlinier eller klonlinier) og kun adskiller sig i punktmutationer. Befolkningsundersøgelser af det sene røde patogen og analyse af klonale linjer er accelereret markant siden fremkomsten af RFLP-RG57-metoden i begyndelsen af 90'erne i sidste århundrede. Sammen med RFLP-RG57 anvendes parringstype, spektre af peptidase og glucose-6-phosphat-isomerase-isoenzymer og mitokondrie-DNA-type til at identificere klonale linjer. Karakteristikken for de mest almindelige klonlinier er vist i tabel 6.
Klon US-1 dominerede befolkningerne overalt indtil slutningen af 80'erne, hvorefter den begyndte at blive erstattet af andre kloner og forsvandt fra Europa og Nordamerika. Det findes nu i Fjernøsten (Filippinerne, Taiwan, Kina, Japan, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al., 1993), i Afrika (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al., 1994, Vega-Sanchez et. al., 2000; Ochwo et al., 2002) og i Sydamerika (Ecuador, Brasilien, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Ingen stammer, der hører til US-1-linjen, er blevet identificeret i Australien alene. Tilsyneladende kom P. infestans isolater til Australien med endnu en migrationsbølge (Goodwin, 1997).
Klon US-6 vandrede fra det nordlige Mexico til Californien i slutningen af 70'erne og forårsagede en epidemi der i kartofler og tomater efter 32 år uden sygdom. På grund af sin høje aggressivitet fortrængte den US-1-klonen og begyndte at dominere på vestkysten af De Forenede Stater (Goodwin et al., 1995a).
Genotyperne US-7 og US-8 blev opdaget i USA i 1992, og var allerede i 1994 bredt distribueret i USA og Canada. I løbet af en feltsæson er klon US-8 i stand til næsten fuldstændigt at fortrænge klon US-1 i kartoffelplots, der oprindeligt blev inficeret med begge kloner i samme koncentration (Miller og Johnson, 2000).
Kloner BC-1 til BC-4 er blevet identificeret i British Columbia i et lille antal isolater fra Goodwin et al., 1995b). Klon US-11 spredte sig bredt i USA og fortrængte US-1 i Taiwan. Kloner JP-1 og EC-1 er sammen med klon US-1 almindelige i henholdsvis Japan og Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 er en klon, der hersker i Rusland over et stort område fra Moskva-regionen til Sakhalin. I Moskva-regionen blev det opdaget i 1993, og nogle markpopulationer bestod hovedsageligt af stammer af denne klonlinie, meget modstandsdygtige over for metalaxyl. Efter 1993 faldt forekomsten af denne klon markant. Uden for Ural i 1997-1998 blev SIB-1 fundet overalt med undtagelse af Khabarovsk-territoriet (klonen SIB-2 er udbredt der). Den rumlige adskillelse af kloner med forskellige typer parring udelukker den seksuelle proces i Sibirien og Fjernøsten. I modsætning til Sibirien er befolkningen i Moskva-regionen repræsenteret af mange kloner; næsten ethvert isolat har en unik multilocus-genotype (Elansky et al., 2001, 2015). Denne mangfoldighed kan ikke kun forklares ved import af svampestammer fra forskellige dele af verden med importeret frømateriale. Da begge typer parring forekommer i befolkningen, er det muligt, at dets mangfoldighed også skyldes rekombination. I British Columbia antages således fremkomsten af genotyper BC-2, BC-3 og BC-4 på grund af hybridisering af kloner BC-1 og US-6 (Goodwin et al., 1995b). Det er muligt, at hybridstammer findes i Moskva-populationer. For eksempel kan stammer MO-4, MO-8 og MO-11 heterozygote for PEP-locus være hybrider mellem stammer MO-12, MO-21, MO-22 med A2-parringstype og homozygot for en allel af PEP-locus og stammen MO-8, der har A1 parringstype og homozygot for den anden allel af locus. Og hvis dette er tilfældet, og i moderne populationer af P. infestans er der en tendens til en stigning i den seksuelle proces, så vil informationsværdien af analysen af multilokuskloner falde (Elansky et al., 2001, 2015).
Variation i klonlinier
Indtil 90'erne af det 20. århundrede var den klonale linje US-1 udbredt i verden. De fleste af mark- og regionale populationer bestod udelukkende af stammer med US-1-genotypen. Imidlertid blev forskelle mellem isolater også observeret, sandsynligvis forårsaget af en mutationsproces. Mutationer forekom i både nukleart og mitokondrie-DNA og påvirkede blandt andet resistensniveauet mod phenylamidlægemidler og antallet af virulensgener. Linjer, der adskiller sig fra de originale genotyper ved mutationer, er angivet med yderligere tal efter prikken, der følger navnet på den originale genotype (for eksempel US-1.1-mutantlinien i den klonale linje US-1). Fingeraftryks-DNA-linier US-1.5 og US-1.6 indeholder tilbehørslinjer i forskellige størrelser (Goodwin et al., 1995a, 1995b); den klonale linje US-6.3 adskiller sig også fra US-6 i en tilbehørslinje (Goodwin, 1997, tabel 7).
I studiet af mitokondrie-DNA blev det fundet, at kun mitokondrie-DNA af type 1b findes i den klonale linje US-1 (Carter et al., 1990). Imidlertid blev der i studiet af stammer af denne klonafstamning fra Peru og Filippinerne fundet isolater, hvis mitokondrie-DNA-typer afveg fra 1b i nærvær af indsættelser og sletninger (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabel 6. Multilokus-genotyper af nogle P. infestans klonale linjer
Navn | Parringstype | Isozymer | DNA-fingeraftryk | MtDNA-type | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 24 + | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | — |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 24 + | — |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 24 + | — |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | — |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 24 + | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | — |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | — | — |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 24 + | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | — |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 24 + | — |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 24 + | — |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 24 + | — |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
EF-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 24 + | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 24 + | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 24 + | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 24 + | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 24 + | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 24 + | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 24 + | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 24 + | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 22 + | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 23 + | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 24 + | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 24 + | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 24 + | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIa |
Bemærk: * - ingen data.
Tabel 7. Multilocus-genotyper og deres mutante linjer
Navn | Parringstype | | DNA-fingeraftryk (RG57) | noter | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Oprindelig genotype 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutation i PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation i RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutation i RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation i RG57 og PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutation i RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Oprindelig genotype 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutation i PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutation i RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutation i RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutation i RG57 og PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutation i RG57 |
BR 1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Oprindelig genotype 3 |
BR 1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutation i RG57 |
Der er også ændringer i spektrene af isozymer. Som regel er de forårsaget af nedbrydningen af en organisme, der oprindeligt er heterozygot for dette enzym i homozygote. I 1993 identificerede vi på tomatfrugter en stamme med karakteristika, der er typiske for US-1: RG57-fingeraftryk, mitokondrie-DNA-type og 86/100 genotype for glucose-6-phosphatizomerase, men det var homozygot (100/100) for det første peptidaselokus i stedet for en 92/100 heterozygote, der er typisk for denne klonale linje. Vi navngav genotypen for denne stamme MO-17 (tabel 6). Mutantlinierne US-1.1 og US-1.4 adskiller sig også fra US-1 ved mutationer på det første peptidaselokus (tabel 7).
Mutationer, der fører til ændringer i antallet af virulensgener for kartoffel- og tomatvarianter, er ret almindelige. De blev bemærket blandt isolaterne fra den klonale linje US-1 i populationer fra Holland (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polen (Sujkowski et al., 1991), det nordlige Nordamerika (Goodwin et al., ., 1995b). Forskelle i antallet af kartoffelvirulensgener blev også bemærket blandt isolater af klonlinierne US-7 og US-8 i Canada og USA (Goodwin et al., 1995a) blandt isolater af SIB-1-linjen i den asiatiske del af Rusland (Elansky et al., 2001 ).
Isolater med stærke forskelle i resistensniveauerne over for phenylamidlægemidler blev identificeret i monoklonale feltpopulationer, som alle tilhørte den klonale linje Sib-1 (Elansky et al., 2001, tabel 1). Næsten alle stammer af den klonale linie US-1 er meget følsomme over for metalaxyl; dog var stærkt resistente isolater af denne linje isoleret i Filippinerne (Koh et al., 1994) og i Irland (Goodwin et al., 1996).
Moderne populationer af P. infestans
Mellemamerika (Mexico)
P. infestans-befolkningen i Mexico adskiller sig markant fra andre verdenspopulationer, hvilket primært skyldes sin historiske position. Talrige undersøgelser af denne population og beslægtede P. infestans arter af clade Phytophthora såvel som lokale arter af slægten Solanum førte til den konklusion, at udviklingen af patogenet i den centrale del af Mexico skete sammen med udviklingen af værtsplanter og var forbundet med seksuel rekombination (Grünwald, Flier , 2005). Begge parringstyper er repræsenteret i populationen og i lige store forhold og tilstedeværelsen af oosporer i jorden på planter og knolde af kartofler og vildtvoksende arter Solanum bekræfter tilstedeværelsen af en seksuel proces i befolkningen (Fernández-Pavía et al., 2002). Nylige undersøgelser af Toluca-dalen og dens omegn (det formodede oprindelsescenter for patogenet) bekræftede den høje genetiske mangfoldighed hos den lokale befolkning af P. infestans (134 multilocus-genotyper i en prøve på 176 prøver) og tilstedeværelsen af flere differentierede underpopulationer i regionen (Wang et al., 2017). Faktorer, der bidrager til denne differentiering, er den rumlige opdeling af underpopulationer, der er karakteristiske for det centrale Mexicos højland, forskelle i dyrkningsforhold og kartoffelsorter, der anvendes i dale og bjerge, og tilstedeværelsen af vilde tuberøse Solanum-arter, der kan fungere som alternative værter (Fry et al. ., 2009).
Det skal dog bemærkes, at populationerne af P. infestans i det nordlige Mexico er mere klonale og ligner mere de nordamerikanske befolkninger, hvilket kan indikere, at det er de nye genotyper (Fry et al., 2009).
Nordamerika
De nordamerikanske populationer af P. infestans har altid haft en meget enkel struktur, og deres klonale karakter blev etableret længe før brug af mikrosatellitanalyse. Indtil 1987 dominerede den klonale linje US-1 i USA og Canada (Goodwin et al., 1995). I midten af 70'erne, da metalaxylbaserede fungicider dukkede op, begyndte denne klon at blive erstattet af andre, mere resistente genotyper, der migrerede fra Mexico (Goodwin et al., 1998). I slutningen af 90'erne. US-8-genotypen erstattede fuldstændigt US-1-genotypen i USA og blev den dominerende klonlinie på kartofler (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Situationen var anderledes med tomater, der konstant indeholdt flere klonale linjer, og deres sammensætning ændredes fra år til år (Fry et al., 2009).
I 2009 brød en stor epidemi af sen rødme ud i USA på tomater. Et træk ved denne pandemi var dens næsten samtidige forekomst mange steder i det nordøstlige USA, og det viste sig at være forbundet med massivt salg af inficerede tomatplanter i store havecentre (Fry et al., 2013). Afgrødetabene var enorme. Mikrosatellitanalyse af de berørte prøver afslørede, at den pandemiske stamme tilhørte den klonale linie US-22 A2-type parring. I 2009 nåede andelen af denne genotype i den amerikanske befolkning af P. infestans op på 80% (Fry et al., 2013). I de efterfølgende år steg andelen af aggressive genotyper US-23 (hovedsageligt på tomater) og US-24 (på kartofler) støt i befolkningen, men efter 2011 faldt påvisningshastigheden for US-24 betydeligt, og til dato var ca. 90% af patogenpopulationen i USA er repræsenteret af US-23 genotypen (Fry et al., 2015).
I Canada, som i USA, i slutningen af 90'erne. den dominerende genotype US-1 blev fortrængt af US-8, hvis dominerende stilling forblev uændret indtil 2008. I Canada var der alvorlige sorte rødmeepidemier forbundet med salg af inficerede tomatplanter, men de var forårsaget af genotyperne US-2009 og US-2010 (Kalischuk et al., 23). Den tydelige geografiske differentiering af disse genotyper var bemærkelsesværdig: US-8 dominerede de vestlige provinser i Canada (2012%), mens US-23 dominerede de østlige provinser (68%). I de efterfølgende år spredte US-8 sig til de østlige regioner; dog generelt faldt dets andel i befolkningen let på baggrund af udseendet af genotyper US-83 og US-23 i landet (Peters et al., 22). Til dato har US-24 en dominerende stilling i hele Canada; US-2014 er til stede i British Columbia, mens US-23 og US-8 er til stede i Ontario (Peters, 23).
Således er de nordamerikanske populationer af P. infestans hovedsageligt klonale linjer. I løbet af de sidste 40 år er antallet af påviste klonegenotyper nået 24. Til trods for at stammer af begge parringstyper er til stede i befolkningen, er sandsynligheden for, at der opstår nye genotyper som et resultat af seksuel rekombination, ganske lav. Ikke desto mindre er der i de sidste 20 år registreret flere tilfælde af forekomne af kortvarige rekombinante populationer (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), og i et tilfælde var krydsningsresultatet genotypen US-11 , som var forankret i Nordamerika i mange år (Gavino et al., 2000). Indtil 2009 var ændringer i befolkningens struktur forbundet med fremkomsten af nye, mere aggressive genotyper med deres efterfølgende migration og fortrængning af tidligere dominerende forgængere. Hvad skete der i 2009-2010 I USA og Canada viste epifytotika for første gang, at i en globaliserings æra kan udbrud af sygdommen være forbundet med aktiv spredning af nye genotyper, når de sælger inficeret plantemateriale.
Sydamerika
Indtil for nylig var undersøgelser af de sydamerikanske populationer af P. infestans hverken regelmæssige eller store. Det vides, at strukturen af disse populationer er ret enkel og inkluderer 1-5 klonale slægter pr. Land (Forbes et al., 1998). Så i 1998 blev genotyperne US-1 (Brasilien, Chile) BR-1 (Brasilien, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peru og Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 og AR-5 (Argentina), PE-3 og PE-7 (det sydlige Peru). Parringstype A2 var til stede i Brasilien, Bolivia og Argentina og blev ikke fundet ud over den boliviansk-peruvianske grænse i området Titicaca-søen, bag hvilken EC-1 A1-genotypen dominerede i Andesbjergene. På tomater forblev US-1 den dominerende genotype i hele Sydamerika.
Situationen vedblev mere eller mindre i 2000'erne. Et vigtigt punkt var opdagelsen af en ny klonal linje EC-2 af A2-typen på vilde slægtninge til kartofler (S. brevifolium og S. tetrapetalum) i de nordlige Andesbjergene (Oliva et al., 2010). Fylogenetiske undersøgelser har vist, at denne linje ikke er helt identisk med P. infestans, skønt den er nært beslægtet med den, blev det i denne forbindelse foreslået at overveje den samt en anden linje, EC-3, isoleret fra tomattræet S. betaceum, der voksede i Andesbjergene, en ny art kaldet P. andina; status for denne art (en uafhængig art eller en hybrid af P. infestans med en stadig ukendt linje) er dog stadig uklar (Delgado et al., 2013).
I øjeblikket er alle sydamerikanske populationer af P. infestans klonale. På trods af tilstedeværelsen af begge parringstyper er der ikke identificeret nogen rekombinante populationer. På tomater er US-1-genotypen allestedsnærværende, tilsyneladende fortrængt fra kartofler af lokale stammer, hvis nøjagtige oprindelse stadig ikke er kendt. I Brasilien, Bolivia og Uruguay er BR-1-genotypen til stede; i Peru er der sammen med US-1 og EC-1 flere andre lokale genotyper. I Andesbjergene bevares den dominerende stilling ved den klonale linje EC-1, hvis forhold til den for nylig opdagede P. andina forbliver uudforsket. Det eneste "ustabile" sted hvor for perioden 2003-2013. der var betydelige ændringer i befolkningen, blev Chile (Acuña et al., 2012), hvor i 2004-2005. patogenpopulationen blev karakteriseret ved resistens over for metalaxyl og en ny mitokondrie DNA-haplotype (Ia i stedet for den tidligere nuværende Ib). 2006 til 2011 I befolkningen dominerede genotype 21 (ifølge SSR), hvis andel nåede 90%, hvorefter håndfladen gik til genotype 20, hvor hyppigheden af forekomst i de næste to år blev holdt på ca. 67% (Acuña, 2015).
Europa
I Europas historie har der været mindst to migrationsbølger af P. infestans fra Nordamerika: i det 1. århundrede. (HERB-1) og begyndelsen af det 70. århundrede (US-1). Den allestedsnærværende fordeling af metalaxylholdige fungicider i XNUMX'erne. førte til forskydning af den dominerende genotype US-XNUMX og dens erstatning med nye genotyper. Som et resultat, i de fleste lande i Vesteuropa, var patogenpopulationerne hovedsageligt repræsenteret af flere klonale linjer.
Anvendelsen af mikrosatellitanalyse til analyse af patogenpopulationer gjorde det muligt at afsløre alvorlige ændringer, der opstod i Vesteuropa i 2005-2008. I 2005 blev der opdaget en ny klonal linje i Storbritannien, kaldet 13_A2 (eller "Blue 13") og karakteriseret ved A2-parringstypen , høj aggressivitet og resistens over for phenylamider (Shaw et al., 2007). Den samme genotype blev fundet i prøver, der blev indsamlet i 2004 i Holland og Nordfrankrig, hvilket antydede, at den vandrede til Storbritannien fra det kontinentale Europa, muligvis med læggekartofler (Cooke et al., 2007). Undersøgelsen af genomet fra repræsentanter for denne klonale linje viste en høj grad af polymorfisme af dens sekvens (i 2016 nåede antallet af dens subklonale variationer 340) og en signifikant grad af variation i niveauet for genekspression, inkl. effektorgener under planteinfektion (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Disse træk sammen med den øgede varighed af den biotrofiske fase kunne forårsage en øget aggressivitet på 13_A2 og dens evne til at inficere selv kartoffelsorter, der er resistente over for sen rødme.
I de næste par år spredte genotypen sig hurtigt over landene i det nordvestlige Europa (Storbritannien, Irland, Frankrig, Belgien, Holland, Tyskland) med samtidig forskydning af de tidligere dominerende genotyper 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Ifølge hjemmesiden www.euroblight.net nåede andelen af 13_A2 i befolkningen i disse lande op på 60-80% og mere; tilstedeværelsen af denne genotype er også blevet registreret i nogle lande i Øst- og Sydeuropa. Imidlertid i 2009-2012. 13_A2 mistede sine dominerende positioner i Storbritannien og Frankrig og gav efter for 6_A1-linjen (8_A1 i Irland), og i Holland og Belgien blev den delvist erstattet af genotyper 1_A1, 6_A1 og 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Til dato er omkring 70% af den vesteuropæiske befolkning af P. infestans monoklonale. Ifølge webstedet www.euroblight.net er de dominerende genotyper i landene i det nordvestlige Europa (Storbritannien, Frankrig,
Holland, Belgien) forbliver, omtrent i lige store mængder, 13_A2 og 6_A1, og sidstnævnte forekommer praktisk talt ikke uden for den specificerede region (med undtagelse af Irland), men har allerede mindst 58 underkloner (Cooke, 2017). Variationer 13_A2 er til stede i mærkbart antal i Tyskland og observeres også sporadisk i landene i Central- og Sydeuropa. Genotype 1_A1 udgør en betydelig del af befolkningen i Belgien og delvist Holland og Frankrig. Genotype 8_A1 har stabiliseret sig i den europæiske befolkning på niveauet 3-6% med undtagelse af Irland, hvor det bevarer sin førende position og er opdelt i to underkloner (Stellingwerf, 2017). Endelig var der i 2016 en stigning i hyppigheden af forekomst af nye genotyper 36_A2 og 37_A2, først registreret i 2013-2014; til dato findes disse genotyper i Holland og Belgien og dels i Frankrig og Tyskland såvel som i den sydlige del af Storbritannien (Cooke, 2017). Cirka 20-30% af den vesteuropæiske befolkning repræsenteres af unikke genotyper hvert år.
I modsætning til Vesteuropa var befolkningen i Nordeuropa (Sverige, Norge, Danmark, Finland), da 13_A2-genotypen dukkede op, ikke repræsenteret af kloniske linjer, men af et stort antal unikke genotyper (Brurberg et al.,
2011). I perioden med aktiv spredning af 13_A2 i Vesteuropa blev tilstedeværelsen af denne genotype i Skandinavien ikke bemærket før i 2011, da den først blev opdaget i Nordjylland (Danmark), hvor der hovedsagelig dyrkes industrielle kartoffelsorter med aktiv anvendelse af metalaxylholdige fungicider (Nielsen et al., 2014). Ifølge www.euroblight.net blev genotype 13_A2 også påvist i flere prøver fra Norge og Danmark i 2014 og i flere norske prøver i 2016; derudover blev der i 2013 noteret tilstedeværelsen af genotype 6_A1 i en lille mængde i Finland. Hovedårsagen til svigt af 13_A2 og andre klonlinjer i erobringen af Skandinavien betragtes som klimatiske forskelle i denne region fra landene i Vesteuropa.
Ud over det faktum, at kølige somre og kolde vintre bidrager til overlevelsen af ikke så meget vegetativt mycelium som oosporer (Sjöholm et al., 2013), bidrager jordfrysning om vinteren (som normalt ikke forekommer i varmere lande i Vesteuropa) til synkronisering af oospores spiring og plantning. kartoffel, som forbedrer deres rolle som kilde til primær infektion (Brurberg et al., 2011). Det skal også bemærkes, at udviklingen af infektion fra oosporer under nordlige forhold overgår udviklingen af knoldinfektion, hvilket i sidste ende forhindrer dominansen af endnu mere aggressive, men senere udviklede klonale linjer (Yuen, 2012). Strukturen for de mest undersøgte populationer af P. infestans i Østeuropa (Polen, de baltiske stater) svarer meget til den i Skandinavien.
Begge typer parring er også til stede her, og langt størstedelen af genotyper bestemt ved SSR-analyse er unikke (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Som i Nordeuropa påvirkede fordelingen af klonlinier (primært af 13_A2-genotypen) praktisk talt ikke de lokale populationer af patogenet, som bevarer et højt niveau af mangfoldighed med fraværet af udtalt dominerende linjer.
Tilstedeværelsen af 13_A2 observeres lejlighedsvis i marker med kommercielle kartoffelsorter. I Rusland udvikler situationen sig på en lignende måde. Mikrosatellitanalyse af P. infestans isolater indsamlet i 2008-2011 i 10 forskellige regioner i den europæiske del af Rusland, viste en høj grad af genotypisk mangfoldighed og en fuldstændig mangel på sammenfald med europæiske klonlinier (Statsyuk et al., 2014). Flere år senere viste en undersøgelse af P. infestans-prøver indsamlet i Leningrad-regionen i 2013-2014 signifikante forskelle mellem dem og genotyperne fra denne region identificeret i den tidligere undersøgelse. I begge undersøgelser blev vesteuropæiske genotyper ikke fundet (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Den høje genetiske mangfoldighed af de østeuropæiske populationer af P. infestans og fraværet af dominerende klonlinier i dem kan være relateret til flere årsager. For det første, som i Nordeuropa, bidrager de klimatiske forhold i de betragtede lande til dannelsen af oosporer som en primær infektionskilde (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). For det andet dyrkes en betydelig andel af kartofler, der produceres i disse lande, på små private gårde, ofte omgivet af skove eller andre hindringer for den frie bevægelighed for infektiøst materiale (Chmielarz et al., 2014). Som regel behandles kartofler, der dyrkes under sådanne forhold, praktisk talt ikke med kemikalier, og valg af sorter er baseret på deres modstandsdygtighed over for sen rødme, dvs. der er ikke noget selektivt pres for aggressivitet og resistens over for metalaxyl, hvilket fratager resistente genotyper, såsom 13_A2, fordele i forhold til andre genotyper (Chmielarz et al., 2014). Endelig, på grund af den lille størrelse af jordarealer, praktiserer deres ejere normalt ikke sædskifte, idet de dyrker kartofler i årevis på samme sted, hvilket bidrager til akkumulering af et genetisk forskelligt inokulum (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asien
Indtil for nylig forblev P. infestans befolkning i Asien relativt dårligt forstået. Det vides, at det hovedsageligt er repræsenteret af klonale linjer, og effekten af seksuel rekombination på fremkomsten af nye genotyper er meget lille. Så for eksempel i 1997-1998. I den asiatiske del af Rusland (Sibirien og Fjernøsten) var patogenpopulationen kun repræsenteret af tre genotyper med en overvægt af SIB-1-genotypen (Elansky et al., 2001). Tilstedeværelsen af klonale patogenlinjer er vist i lande som Kina, Japan, Korea, Filippinerne og Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Den klonale linje US-1, der dominerede over et stort område i Asien, i slutningen af 90'erne - begyndelsen af 2000'erne. næsten overalt begyndte at blive erstattet af andre genotyper, som igen gav plads til nye. I de fleste tilfælde var ændringer i struktur og sammensætning af befolkninger i asiatiske lande forbundet med migration af nye genotyper udefra. Således har Japan, med undtagelse af JP-3-genotypen, alle andre japanske genotyper, der optrådte efter US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) mere eller mindre bevist ekstern oprindelse (Akino et al., 2011) ... I Kina er der i øjeblikket tre hovedpatogenpopulationer med en klar geografisk opdeling; Der er ingen eller meget svag genstrøm mellem disse populationer (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotype 13_A2 dukkede op på Kinas territorium i de sydlige provinser (Yunnan og Sichuan) i 2005-2007 og i 2012-1014. blev også set i den nordøstlige del af landet (Li et al., 2013b). I Indien optrådte 13_A2 formodentlig på samme tid som i Kina, sandsynligvis med inficerede læggekartofler (Chowdappa et al., 2015) og i 2009-2010. forårsagede en alvorlig epifytotisk sygdom med sen rødme på tomat i det sydlige land, hvorefter den spredte sig til kartofler og i 2014 forårsagede et udbrud af sen rødme i Vestbengalen, hvilket førte til ruin og selvmord hos mange lokale landmænd (Fry, 2016).
Afrika
Indtil 2008-2010 systematiske undersøgelser af P. infestans i afrikanske lande er ikke blevet udført. I øjeblikket kan de afrikanske populationer af P. infestans opdeles i to grupper, og denne opdeling er tydeligt forbundet med importen af læggekartofler fra Europa.
I Nordafrika, der aktivt importerer læggekartofler fra Europa, er parringstypen A2 bredt repræsenteret i næsten alle regioner, hvilket giver en teoretisk mulighed for fremkomsten af nye genotyper som et resultat af seksuel rekombination (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Derudover bemærkes tilstedeværelsen af genotyper 13_A2, 2_A1 og 23_A1 i Algeriet med en udtalt dominans af den første af dem samt et gradvist fald i andelen af unikke genotyper indtil fuldstændig forsvinden (Rekad et al., 2017). I modsætning til resten af regionen er patogenpopulationen i Tunesien (med undtagelse af det nordøstlige land) hovedsagelig repræsenteret af A1-parringstypen (Harbaoui et al., 2014).
Den klonale linje NA-01 er dominerende her. Generelt er andelen af klonlinier i befolkningen kun 43%. I det østlige og sydlige Afrika, hvor mængden af import af frø er forsvindende lille (Fry et al., 2009), er P. infestans kun repræsenteret af to klonale A1-linier, US-1 og KE-1, og sidstnævnte fortrænger aktivt førstnævnte på kartofler ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Til dato har begge disse genotyper et mærkbart antal subklonale variationer.
Australien
Den første rapport om sen rødme på kartofler i Australien dateres tilbage til 1907, og den første epifytoti, formodentlig forårsaget af kraftige regn i sommermånederne, fandt sted i 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Generelt har sen rødme imidlertid ingen væsentlig økonomisk betydning for landet. Sporadiske udbrud af sen rødme, fremkaldt af vejrforhold, der giver høj luftfugtighed, forekommer ikke oftere end en gang hvert 5-7 år og er hovedsageligt lokaliseret i det nordlige Tasmanien og det centrale Victoria. I forbindelse med ovenstående er publikationer, der er afsat til undersøgelsen af strukturen i den australske befolkning af P. infestans, næsten fraværende. Den seneste tilgængelige information er fra 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Ifølge forfatterne var befolkningen i staten Victoria en klonal afstamning US-1.3, som indirekte bekræftede migrationen af denne genotype fra De Forenede Stater. De tasmanske prøver blev klassificeret som AU-3, forskellig fra de genotyper, der var til stede på det tidspunkt i andre dele af verden.
Funktioner ved udviklingen af sen rødme i Rusland
I Europa blev infektion indført med syge frøknolde, oosporer, der overvintrede i jorden, samt zoosporangia, der blev bragt af vinden fra planter, der blev dyrket fra overvintrede knolde i sidste års marker ("frivillige" planter) eller på bunke afskåret bogmærke til opbevaring af knolde. Af disse betragtes planter dyrket på dynger af kasserede knolde som den farligste infektionskilde. der er antallet af spirede knolde ofte signifikant, og zoosporangia kan bæres fra dem over lange afstande. Resten af kilderne (oosporer, "frivillige" planter) er ikke så farlige, fordi det er ikke almindeligt at dyrke planter i de samme marker oftere end en gang hvert 3-4 år. Infektion fra syge frøknolde er også minimal på grund af et godt frøkvalitetskontrolsystem.
Generelt er mængden af inokulum i europæiske populationer begrænset, og derfor er stigningen i epidemien ret langsom og kan med succes kontrolleres ved hjælp af kemiske fungicidpræparater. Hovedopgaven under europæiske forhold er kampen mod infektion i den fase, hvor massedispersionen af zoosporangia fra berørte planter begynder.
I Rusland er situationen radikalt anderledes. Det meste af kartoffel- og tomatafgrøderne dyrkes i små private haver; enten udføres beskyttelsesforanstaltninger overhovedet ikke på dem, eller svampedræbende behandlinger udføres i et utilstrækkeligt antal og begynder efter udseendet af sen rødme på toppen. Som et resultat fungerer private grøntsagshaver som den vigtigste infektionskilde, hvorfra zoosporangia bæres af vinden til kommercielle plantager. Dette bekræftes af vores direkte observationer i Moskva, Bryansk, Kostroma, Ryazan-regionerne: skader på planter i private haver observeres allerede inden starten på fungicidbehandlinger af kommercielle plantager. Derefter begrænses epidemien i store marker ved anvendelse af fungicidpræparater, mens der i private haver er en hurtig udvikling af sen rødme.
I tilfælde af ukorrekte eller "budgetmæssige" behandlinger af kommercielle plantager vises der fokus på sen rødme i markerne; senere udvikler de sig aktivt og dækker stadig større områder (Elansky, 2015). Infektion i private haver har en betydelig indvirkning på epidemier i kommercielle felter. I alle russiske kartoffeldyrkningsregioner er det område, der er optaget af kartofler i private haver, flere gange større end det samlede areal for store producenters marker. I et sådant miljø kan private grøntsagshaver betragtes som en global inokulumressource til kommercielle marker. Lad os prøve at identificere de egenskaber, der er karakteristiske for genotyperne af stammer i private haver.
Plantning af ikke-frø- og karantænekontrol af kartofler, tomatfrø opnået fra tvivlsomme udenlandske producenter, langvarig dyrkning af kartofler og tomater på de samme områder, forkert fungicidbehandling eller deres fuldstændige fravær fører til alvorlige epifytotika i den private sektor, hvis resultat er gratis krydsning, hybridisering og dannelse af oosporer i private haver. Som et resultat observeres en meget høj genotypisk mangfoldighed af patogenet, når næsten hver stamme er unik i sin genotype (Elansky et al., 2001, 2015). Plantning af læggekartofler af forskellig genetisk oprindelse gør det usandsynligt, at der kommer klonlinier, der er specialiserede til at angribe en bestemt sort. De stammer, der er valgt i et sådant tilfælde, adskiller sig ved deres alsidighed i forhold til de berørte sorter, de fleste af dem har tæt på det maksimale antal virulensgener. Dette adskiller sig meget fra systemet med "klonale linjer", der er typisk for store marker inden for landbrugsvirksomheder med et korrekt installeret system til beskyttelse mod sen rødme. "Klonale linjer" (når alle stammer af det sene rødmepatogen i marken er repræsenteret af en eller flere genotyper) er allestedsnærværende i lande, hvor kartoffeldyrkning udelukkende udføres af store gårde: USA, Holland, Danmark osv. I England, Irland, Polen, hvor husholdningsarealer også traditionelt er udbredte kartoffeldyrkning, er der også en højere genotypisk mangfoldighed i private haver. I slutningen af det 20. århundrede var "klonale linjer" udbredt i de asiatiske og fjernøstlige dele af Rusland (Elansky et al., 2001), hvilket tilsyneladende skyldes brugen af de samme kartoffelsorter udelukkende til plantning. For nylig begyndte situationen i disse regioner også at ændre sig mod en stigning i den genotypiske mangfoldighed af populationer.
Manglen på intensive behandlinger med fungicidpræparater har en anden direkte konsekvens - der er ingen ophobning af resistente stammer i haven. Faktisk viser vores resultater, at metalaxylresistente stammer findes signifikant sjældnere i private haver end i kommercielle plantager.
Nærheden af kartoffel- og tomatplantager, der er typisk for private haver, letter migrationen af stammer mellem disse afgrøder, hvilket resulterer i, at det sidste årti blandt stammerne isoleret fra kartofler, andelen af stammer, der bærer genet for resistens over for cherrytomatvarianter (T1), der tidligere kun var tomatstammer. Stammer med T1-genet er i de fleste tilfælde meget aggressive over for både kartofler og tomater.
I de senere år begyndte sen rødme på tomat at forekomme i mange tilfælde tidligere end på kartofler. Tomatplanter kan inficeres med oosporer i jorden eller oosporer, der er til stede i tomatfrø eller overholder dem (Rubin et al., 2001). I de sidste 15 år har et stort antal billige pakkede frø, hovedsagelig importeret, dukket op i butikkerne, og de fleste af de små producenter er skiftet til at bruge dem. Frøene kan bringe stammer med genotyper, der er typiske for regionerne for deres voksende. I fremtiden indgår disse genotyper i den seksuelle proces i private haver, hvilket fører til fremkomsten af helt nye genotyper.
Således kan det siges, at private haver er en global "smeltedigel", hvor eksisterende genotyper behandles, og som et resultat af udvekslingen af genetisk materiale, vises helt nye. Derudover finder deres valg sted under forhold, der er meget forskellige fra dem, der skabes til kartofler på store gårde: fravær af fungicid presse, sort ensartethed af plantninger, overvægt af planter, der er påvirket af forskellige former for viral og bakteriel infektion, nærhed til tomater og vilde natskygge, aktiv krydsning og dannelse af oospore, muligheden for oosporer at fungere som en kilde til infektion det næste år.
Alt dette fører til en meget høj genotypisk mangfoldighed af baggårdspopulationer. Under epifytotika i grøntsagshaver spredes sen rødme meget hurtigt, og store mængder sporer frigøres og flyver til nærliggende kommercielle plantager. Efter at have kommet ind i kommercielle felter med det korrekte system for landbrugsteknologi og kemisk beskyttelse, har de ankomne sporer praktisk talt ingen mulighed for at starte epifytotika i marken, hvilket skyldes manglen på klonlinier, der er resistente over for fungicider og specialiserede over for den dyrkede sort.
En anden kilde til primær inokulum kan være syge knolde fanget i kommercielle kimplanter. Disse knolde blev som regel dyrket på marker med god landbrugsteknologi og intensiv kemisk beskyttelse. Genotyperne af de isolater, der påvirkede knoldene, er tilpasset udviklingen af deres egen sort. Disse stammer er betydeligt farligere for kommerciel beplantning end inokulum, der stammer fra private haver. Resultaterne af vores undersøgelser understøtter også denne antagelse. Bestande isoleret fra store marker med korrekt udført kemisk beskyttelse og god landbrugsteknologi adskiller sig ikke i høj genotypisk mangfoldighed. Ofte er dette flere klonale linjer, der er meget aggressive.
Stammer fra kommercielt frømateriale kan komme ind i populationer i køkkenhave og være involveret i de processer, der foregår i dem. Men i en køkkenhave vil deres konkurrenceevne være meget lavere end inden for et kommercielt felt, og snart vil de ophøre med at eksistere i form af en klonal linje, men deres gener kan bruges i "haven" -populationen.
Infektionen, der udvikler sig på "frivillige" planter og på dynger af aflivet knolde under høst, er ikke så relevant for Rusland, fordi I de vigtigste kartoffeldyrende regioner i Rusland observeres dyb vinterfrysning af jord, og planter fra knolde, der har overvintret i jorden, udvikler sig sjældent. Desuden, som vores eksperimenter viser, overlever det sene rødmepatogen ikke ved negative temperaturer, selv på knolde, der har bevaret deres levedygtighed. I den tørre zone, hvor dyrkning af tidlige kartofler praktiseres, er sen rødme ret sjælden på grund af den tørre og varme vækstsæson.
Således observerer vi i øjeblikket opdeling af P. infestans-populationer i "felt" og "have" -populationer. Imidlertid er der i de senere år observeret processer, der fører til konvergens og interpenetration af genotyper fra disse populationer.
Blandt dem kan man bemærke en generel stigning i læsefærdigheden hos små producenter, fremkomsten af overkommelige små pakker med læggekartofler, spredning af fungicidpræparater i små pakker og tabet af frygt for "kemi" af befolkningen.
Situationer opstår, at hele landsbyerne takket være en leverandørs energiske aktivitet er plantet med frøknolde af samme sort og forsynet med små pakker med de samme pesticider. Det kan antages, at kartofler af samme sort findes på kommercielle plantager i nærheden.
På den anden side fremmer nogle pesticidhandelsselskaber "budgetmæssige" kemiske behandlingsordninger. I dette tilfælde undervurderes antallet af anbefalede behandlinger, og de billigste fungicider tilbydes, og vægten lægges ikke på at forhindre udviklingen af sen blight op til klipning af toppe, men på en vis forsinkelse i epifytoty for at øge udbyttet. Sådanne ordninger er økonomisk berettigede, når der dyrkes ware kartofler af lavkvalitets frømateriale, når der i princippet ikke er tale om at opnå et højt udbytte. I modsætning til havepopulationer bidrager kartoffelens udjævnede genetiske baggrund imidlertid til udvælgelsen af specifikke fysiologiske racer, som er meget farlige for denne sort.
Generelt synes tendenser til konvergens mellem "have" og "felt" -metoder til kartoffelproduktion for os ret farlige. For at forhindre deres negative konsekvenser, både i hjemmet og i den kommercielle sektor, vil det være nødvendigt at kontrollere både sortimentet af læggekartofler og antallet af fungicider, der tilbydes private ejere i mindre emballager, samt sporing af kartoffelbeskyttelsesordninger og brugen af fungicider i den kommercielle sektor.
Inden for den private sektor er der en intensiv udvikling af ikke kun sene rødme, men også Alternaria. De fleste ejere af private gårde træffer ikke særlige forholdsregler for at beskytte mod Alternaria, idet de tager fejl af udviklingen af Alternaria for den naturlige visning af løvet eller udviklingen af sen rødme. Derfor, med den massive udvikling af Alternaria på modtagelige sorter, kan husholdningsarealer tjene som kilde til inokulum til kommercielle plantager.
Mekanismer for variation
Mutationsproces
Da forekomsten af mutationer er en tilfældig proces, der fortsætter med en lav frekvens, afhænger forekomsten af mutationer på ethvert sted af frekvensen af mutation af dette locus og størrelsen af befolkningen. Når man studerer hyppigheden af mutationer af P. infestans stammer, bestemmes normalt antallet af kolonier, der dyrkes på selektive næringsmedier efter behandling med kemiske eller fysiske mutagener. Som det kan ses af dataene præsenteret i tabel 8, kan mutationsfrekvensen for den samme stamme på forskellige loci afvige med flere størrelsesordener. Den høje frekvens af mutationer i resistens over for metalaxyl kan være en af grundene til akkumulering af stammer, der er resistente over for det i naturen.
Hyppigheden af spontane eller inducerede mutationer, beregnet på basis af laboratorieeksperimenter, svarer ikke altid til de processer, der forekommer i naturlige populationer af følgende årsager:
1. Med asynkrone nukleare fissioner er det umuligt at estimere hyppigheden af mutationer pr. Nuklear generation. Derfor giver de fleste eksperimenter kun information direkte om hyppigheden af mutationer uden at skelne mellem to mutationsbegivenheder og en begivenhed efter mitose.
2. Enkelttrinsmutationer reducerer normalt balancen i genomet, derfor sammen med erhvervelsen af en ny egenskab falder organismenes generelle egnethed. De fleste af de eksperimentelt opnåede mutationer har en reduceret aggressivitet og registreres ikke i naturlige populationer. Således var korrelationskoefficienten mellem resistensgraden for P. infestans mutanter over for phenylamid fungicider og vækstraten i et kunstigt miljø i gennemsnit (-0,62), og resistensen over for fungicider og aggressivitet på kartoffelblade (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), hvilket indikerer den lave egnethed af mutanterne. Mutationer af resistens over for dimethomorph ledsages også af et kraftigt fald i levedygtighed (Bagirova et al., 2001).
3. De fleste af de spontane og inducerede mutationer er recessive og manifesterer sig ikke fænotypisk i eksperimenter, men udgør en skjult reserve for variation i naturlige populationer. Mutantstammer isoleret i laboratorieforsøg bærer dominerende eller semi-dominerende mutationer (Kulish og Dyakov, 1979). Tilsyneladende forklarer nuklear diploidy mislykkede forsøg på at opnå mutanter under påvirkning af UV-bestråling, der er virulente på tidligere resistente sorter (McKee, 1969). Ifølge forfatterens beregninger kan sådanne mutationer forekomme med en frekvens på mindre end 1: 500000. Overgangen af recessive mutationer til en homozygot, fænotypisk udtrykt tilstand kan forekomme på grund af seksuel eller aseksuel rekombination (se nedenfor). Selv i dette tilfælde kan mutationen dog maskeres af de dominerende alleler af vildtypekerne i det cenotiske (multinukleare) mycelium og kun fænotypisk fikseres under dannelsen af mononukleære zoosporer.
Tabel 8. Hyppighed af P. infestans mutationer til væksthæmmende stoffer under påvirkning af nitrosomethylurinstof (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Tilslutning | Mutationsfrekvens |
Oxytetracyclin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomycin | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Cycloheximid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Befolkningsstørrelser spiller også en afgørende rolle i forekomsten af spontane mutationer. I meget store populationer, hvor antallet af celler N> 1 / a, hvor a er mutationshastigheden, ophører mutationen med at være et tilfældigt fænomen (Kvitko, 1974).
Beregninger viser, at med en gennemsnitlig angreb af en kartoffelmark (35 pletter pr. Plante) dannes der 8x1012 sporer dagligt på en hektar (Dyakov og Suprun, 1984). Tilsyneladende indeholder sådanne populationer alle mutationer, der er tilladt efter typen af udveksling på hvert sted. Selv en sjælden mutation, der forekommer med en frekvens på 10-9, vil blive erhvervet af tusind individer ud af de millioner, der lever på en hektar kartoffelmark. For mutationer, der forekommer med en højere frekvens (for eksempel 10-6), i en sådan population, kan forskellige parrede mutationer forekomme dagligt (samtidigt på to loci), dvs. mutationsprocessen vil erstatte rekombination.
Migrationer
For P. infestans er to hovedtyper af migration kendt: at lukke afstande (inden for en kartoffelmark eller tilstødende marker) ved at sprede zoosporangia med luftstrømme eller regnspray og til lange afstande - med plantning af knolde eller transporterede tomatfrugter. Den første metode giver mulighed for udvidelse af sygdommens fokus, den anden - oprettelse af nye foci på steder fjernt fra det primære.
Spredning af infektion med tomatknolde og frugt bidrager ikke kun til sygdommens fremkomst nye steder, men er også den vigtigste kilde til genetisk mangfoldighed i populationer. I Moskva-regionen dyrkes kartofler fra forskellige regioner i Rusland og Vesteuropa. Tomatfrugter bringes fra de sydlige regioner i Rusland (Astrakhan Region, Krasnodar Territory, Nordkaukasus). Tomatfrø, som også kan tjene som infektionskilder (Rubin et al., 2001), importeres også fra de sydlige regioner i Rusland, Kina, europæiske lande og andre lande.
Ifølge beregninger af E. Mayr (1974) overstiger genetiske ændringer i en lokal befolkning forårsaget af mutationer sjældent 10-5 pr. Locus, mens i åbne populationer er udvekslingen på grund af modstrømmen af gener mindst 10-3 - 10-4.
Migration i inficerede knolde er ansvarlig for P. infestans indrejse i Europa og spredes til alle regioner i verden, hvor kartofler dyrkes; de forårsagede de mest alvorlige befolkningsændringer. Sen rødme på kartofler dukkede op på det russiske imperium næsten samtidig med dets udseende i Vesteuropa.
Da sygdommen først blev noteret i 1846-1847 i de baltiske stater og kun i de efterfølgende år spredt sig i Hviderusland og de nordvestlige regioner i Rusland, er dens vesteuropæiske oprindelse åbenbar. Den første kilde til sen rødme i den gamle verden er ikke så indlysende. Hypotesen udviklet af Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) antyder, at parasitten først kom fra Mexico til Nordamerika, hvor den spredte sig gennem afgrøder og derefter blev transporteret til Vesteuropa. (fig. 7).
Som et resultat af den gentagne drift (dobbelt effekt af "flaskehalsen") kom enkelte kloner til Europa, hvis afkom forårsagede en pandemi i hele den gamle verdens territorium, hvor kartofler dyrkes. Som bevis for denne hypotese nævner forfatterne for det første den allestedsnærværende forekomst af kun en type parring (A1) og for det andet homogeniteten af genotyperne af de undersøgte stammer fra forskellige regioner (alle er baseret på molekylære markører, inklusive 2 isozyme loci, DNA-fingeraftryksmønstre og strukturen af mitokondrie-DNA er identisk og svarer til klonen US-1 beskrevet i USA). Imidlertid rejser nogle data tvivl om i det mindste nogle af bestemmelserne i den angivne hypotese. Analyse af P. infestans mitokondrie-DNA isoleret fra herbarium kartoffelprøver inficeret i den første epifytotiske periode i 40'erne viste, at de adskiller sig i strukturen af mitokondrie-DNA fra klon US-1, som derfor i det mindste var ikke den eneste infektionskilde i Europa (Ristaino et al, 2001).
Den sene røde situation forværredes igen i 80'erne af det XX århundrede. Følgende ændringer er sket:
1) Befolkningens gennemsnitlige aggressivitet er steget, hvilket især har ført til den udbredte spredning af den mest skadelige form for sen rødme - skader på bladstængler og stilke.
2) Der var et skift i tiden for sen rødme på kartofler - fra slutningen af juli til begyndelsen af juli og endda til slutningen af juni.
3) A2-parringstypen, der tidligere var fraværende i den gamle verden, er blevet allestedsnærværende.
Forandringerne blev forud for to begivenheder: den massive anvendelse af det nye fungicid metalaxyl (Schwinn og Staub, 1980) og fremkomsten af Mexico som en verdenseksportør af kartofler (Niederhauser, 1993). I overensstemmelse med dette blev der fremsat to grunde til befolkningsændringer: konvertering af parringstypen under indflydelse af metalaxyl (Ko, 1994) og den massive introduktion af nye stammer med inficerede knolde fra Mexico (Fry og Goodwin, 1995). Selvom interkonvertering af parringstyper under indflydelse af metalaxyl blev opnået ikke kun af Ko, men også i arbejder udført på laboratoriet ved Moskva State University (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), foretrækkes den anden hypotese. Sammen med fremkomsten af den anden parring fandt der alvorlige ændringer sted i genotyperne af russiske P. infestans-stammer, herunder i neutrale gener (isozym og RFLP loci) såvel som i strukturen af mitokondrie-DNA. Komplekset af disse ændringer kan ikke forklares ved metalaxyls virkning; snarere var der en massiv import af nye stammer fra Mexico, der, da de var mere aggressive (Kato et al., 1997), fordrev de gamle stammer (US-1) og blev dominerende i befolkningen. Ændringen i sammensætningen af europæiske befolkninger fandt sted på meget kort tid - fra 1980 til 1985 (Fry et al., 1992). På det tidligere USSR's territorium blev der fundet "nye stammer" i samlinger fra Estland i 1985, dvs. tidligere end i Polen og Tyskland (Goodwin et al., 1994). Sidste gang den "gamle stamme US-1" i Rusland blev isoleret fra en inficeret tomat i Moskva-regionen i 1993 (Dolgova et al., 1997). Også i Frankrig blev der fundet "gamle" stammer i tomatplantager indtil begyndelsen af 90'erne, det vil sige efter at de længe var forsvundet på kartofler (Leberton og Andrivon, 1998). Ændringer i P. infestans stammer påvirkede mange træk, herunder dem af stor praktisk betydning, og øgede skadeligheden ved sen rødme.
Seksuel rekombination
For at seksuel rekombination kan bidrage til variabiliteten, er det først og fremmest nødvendigt tilstedeværelsen af to typer parring i befolkningen i et forhold tæt på 1: 1 og for det andet tilstedeværelsen af initial populationsvariabilitet.
Forholdet mellem parringstyper varierer meget i forskellige populationer og endda i forskellige år i en befolkning (tabel 9,10, 90). Årsagerne til sådanne drastiske ændringer i hyppigheden af parringstyper i populationer (som for eksempel i Rusland eller i Israel i begyndelsen af 2002'erne i sidste århundrede) er ukendte, men det menes at dette skyldes introduktionen af mere konkurrencedygtige kloner (Cohen, XNUMX).
Nogle indirekte data indikerer forløbet af den seksuelle proces i visse år og i visse regioner:
1) Undersøgelser af populationer fra Moskva-regionen viste, at i 13 populationer, hvor andelen af A2-parringstype var mindre end 10%, var den samlede genetiske diversitet beregnet for tre isozyme loci 0,08, og i 14 populationer, hvor andelen af A2 oversteg 30% var den genetiske mangfoldighed dobbelt så høj (0,15) (Elansky et al., 1999). Jo højere sandsynligheden for samleje er, jo større er befolkningens genetiske mangfoldighed.
2) Forholdet mellem forholdet mellem parringstyper i populationer og intensiteten af oosporedannelse blev observeret i Israel (Cohen et al., 1997) og i Holland
(Flier et al., 2004). Vores undersøgelser har vist, at der i populationer, hvor isolater med A2-parringstypen tegnede sig for 62, 17, 9 og 6%, blev fundet oosporer i henholdsvis 78, 50, 30 og 15% af de analyserede kartoffelblade (med 2 eller flere pletter).
Prøver med 2 eller flere pletter indeholdt signifikant oftere oosporer end prøver med 1 plet (henholdsvis 32 og 14% af prøverne) (Apryshko et al., 2004).
Oosporer var meget mere almindelige i bladene på det midterste og nedre lag af kartoffelplanten (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) I nogle regioner er der opdaget unikke genotyper, hvis forekomst er forbundet med seksuel rekombination. I Polen i 1989 og i Frankrig i 1990 stammer således homozygote for glucose-6-
phosphatisomerase (GPI 90/90). Da der tidligere kun var 10/90 heterozygoter i 100 år, tilskrives homozygositet seksuel rekombination (Sujkowski et al., 1994). I Colombia (USA) er isolater, der kombinerer A2 med GPI 100/110 og A1 med GPI 100/100 almindelige, men i slutningen af 1994-sæsonen (16. august og 9. september) er stammer med rekombinante genotyper (A1 GPI 100/110 og A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) I nogle populationer fra Polen (Sujkowski et al., 1994) og Nordkaukasus (Amatkhanova et al., 2004) svarer fordelingen af fingeraftryks-DNA loci og allozymprotein loci til Hardy-Weinberg-fordelingen, hvilket indikerer
om den høje andel af bidraget fra seksuel rekombination til populationernes variation. I andre regioner i Rusland blev der ikke fundet nogen korrespondance med Hardy-Weinberg-fordeling i populationer, men tilstedeværelsen af sammenkædningsbalance blev vist, hvilket indikerer overvægten af klonal reproduktion (Elansky et al., 1999).
5) Genetisk mangfoldighed (GST) mellem stammer med forskellige parringstyper (A1 og A2) var lavere end mellem forskellige populationer (Sujkowski et al., 1994), hvilket indirekte indikerer seksuelle krydsninger.
Samtidig kan bidraget fra seksuel rekombination til befolkningens mangfoldighed ikke være meget højt. Dette bidrag blev beregnet for befolkningerne i Moskva-regionen (Elansky et al., 1999). Ifølge beregningerne fra Lewontin (1979) bliver "rekombination, der kan producere nye varianter fra to loci med en frekvens, der ikke overstiger produktet af deres heterozygositeter, kun effektiv, hvis værdierne for heterozygositet for begge alleler allerede er høje."
Med forholdet mellem de to typer parring, som er typisk for Moskva-regionen, lig med 4: 1, vil rekombinationsfrekvensen være 0,25. Sandsynligheden for at krydsede stammer vil være heterozygot for to af de tre undersøgte isozygote loci i de undersøgte populationer var 0,01 (2 stammer ud af 177). Derfor bør sandsynligheden for forekomst af dobbelt heterozygoter som et resultat af rekombination ikke overstige deres produkt ganget med sandsynligheden for krydsning (0,25x0,02x0,02) = 10-4, dvs. seksuelle rekombinanter falder normalt ikke ind i den undersøgte prøve af stammer. Disse beregninger blev foretaget for befolkninger fra Moskva-regionen, som er kendetegnet ved relativt stor variation. I monomorfe populationer som de sibiriske kan den seksuelle proces, selvom den forekommer i individuelle populationer, ikke påvirke deres genetiske mangfoldighed.
Derudover er P. infestans kendetegnet ved hyppig forskydning af kromosom i meiose, hvilket fører til aneuploidi (Carter et al., 1999). Sådanne overtrædelser reducerer hybridernes fertilitet.
Parasexual rekombination, mitotisk genkonvertering
I eksperimenter med splejsning af P. infestans stammer med mutationer i resistens over for forskellige vækstinhibitorer, blev fremkomsten af misolater resistente over for begge inhibitorer fundet (Shattock og Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Stammer, der er resistente over for to væksthæmmere, opstod som et resultat af heterokaryotisering af myceliet, og i dette tilfælde spaltede de under reproduktion af mononukleære zoosporer (Judelson, Ge Yang, 1998) eller spaltede ikke i monozoosporøse afkom, fordi de havde tetraploide (da de første isolater er diploide) kerner (K 1979). Heterozygote diploider adskilt ved en meget lav frekvens på grund af haploidisering, kromosom-ikke-adskillelse og mitotisk passage (Poedinok et al., 1982). Hyppigheden af disse processer kunne øges ved hjælp af visse handlinger på heterozygote diploider (for eksempel UV-bestråling af spirende sporer).
Selvom dannelsen af vegetative hybrider med dobbelt resistens ikke kun forekommer in vitro, men også i kartoffelknolde inficeret med en blanding af mutanter (Kulish et al., 1978), er det ret vanskeligt at vurdere rollen som parasexuel rekombination i dannelsen af nye genotyper i populationer. Hyppigheden af segregantsdannelse på grund af haplooidisering, ikke-adskillelse af kromosomer og mitotisk overgang uden specielle effekter er ubetydelig (mindre end 10-3).
Fremkomsten af homozygote segreganter af heterozygote stammer kan være baseret på både mitotisk passage og mitotisk genkonvertering, som i P. sojae forekommer med en frekvens på 3 x 10-2 til 5 x 10-5 pr. Locus, afhængigt af stammen (Chamnanpunt et al. , 2001).
Selvom hyppigheden af forekomsten af heterokaryoner og heterozygote diploider viste sig at være uventet høj (når ti procent), sker denne proces kun, når mutante kulturer opnået fra den samme stamme splejses. Ved anvendelse af forskellige stammer isoleret fra naturen forekommer ikke heterokaryotisering (eller forekommer med en meget lav frekvens) på grund af tilstedeværelsen af vegetativ inkompatibilitet (Poedinok og Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Derfor kan rollen som parasexuel rekombination kun reduceres til intraklonal rekombination i heterozygote kerner og overgangen af individuelle gener til en homozygot tilstand uden en seksuel proces. Denne proces kan have epidemiologisk betydning i stammer med recessive eller semi-dominerende fungicidresistensmutationer. Dens overgang til en homozygot tilstand på grund af den parasexuelle proces vil øge modstanden hos bæreren af mutationen (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introduktion af gener
Heterotalliske arter Phytophthora er i stand til at krydse med dannelsen af hybrid oosporer (se Vorob'eva og Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Den naturlige hybrid af de to Phytophthora-arter var så aggressiv, at den dræbte tusinder af aldere i Storbritannien (Brasier et al., 1999). P. infestans kan forekomme med andre arter af slægten (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum osv.) På almindelige værtsplanter og i jorden, men der er kun få oplysninger i litteraturen om muligheden for interspecifikke hybrider. Under laboratorieforhold blev hybrider opnået mellem P. infestans og P. Mirabilis (Goodwin og Fry, 1994).
Tabel 9. Andelen af P. infestans stammer med A2-parringstype i forskellige lande i verden i perioden 1990 til 2000 (ifølge data fra åbne litteraturkilder og websteder www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Land | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Hviderusland | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgien | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estland | 8 (12) | ||||||||||
England | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finland | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Frankrig | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungarn | 72 (32) | ||||||||||
Irland | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holland | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norge | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polen | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skotland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Sverige | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Sydkorea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
porcelæn | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Serbien | 76 (37) | ||||||||||
Mexico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabel 10. Andelen af P. infestans stammer med A2 parringstype i forskellige lande i verden i perioden 2000 til 2011
Land | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Østrig | 65 (83) | ||||||||||
Hviderusland | 42 (78) | ||||||||||
Belgien | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Schweiz | 89 (19) | ||||||||||
Tjekkiet | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Tyskland | 95 (53) | ||||||||||
Danmark | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estland | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
England | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finland | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Frankrig | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungarn | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holland | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norge | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polen | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skotland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Sverige | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakiet | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Sydkorea | 46 (26) | ||||||||||
Brasilien | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
porcelæn | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamik af den genotypiske sammensætning af populationer
Ændringer i den genotypiske sammensætning af P. infestans-populationer kan forekomme under indflydelse af migration af nye kloner fra andre regioner, landbrugspraksis (ændring af sorter, anvendelse af fungicider) og vejrforhold. Eksterne påvirkninger påvirker forskelligt kloner på forskellige stadier af livscyklussen; derfor oplever populationer årligt cykliske ændringer i frekvenser af gener, der er genstand for selektion, på grund af en ændring i den dominerende rolle, som gendrift og selektion.
Indflydelse af sorten
Nye sorter med effektive gener til vertikal resistens (R-gener) er en stærk selektiv faktor, der vælger kloner med komplementære virulensgener i P. infestans-populationer. I mangel af ikke-specifik resistens i kartoffelsorten, der hæmmer væksten af patogenpopulationen, sker processen med at erstatte de dominerende kloner i populationen meget hurtigt. Så efter spredningen i Moskva-regionen af Domodedovsky-sorten, som har R3-resistensgenet, steg frekvensen af kloner virulente for denne sort fra 0,2 til 0,82 på et år (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Ændringen i frekvenserne af virulensgener (patotyper) i populationer forekommer dog ikke kun under indflydelse af dyrkede kartoffelsorter. For eksempel dominerede i Hviderusland indtil 1977 kloner med virulensgener 1 og 4, hvilket var forårsaget af dyrkning af kartoffelsorter med resistensgener R1 og R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). I slutningen af 70'erne af det 2002. århundrede optrådte der imidlertid kloner med forskellige virulensgener og deres kombinationer, og de komplementære resistensgener blev aldrig brugt i kartoffelopdræt (ekstra virulensgener) (Ivanyuk et al., XNUMX). Årsagen til udseendet af sådanne kloner skyldes tilsyneladende migrationen til Europa af smitsomt materiale fra Mexico med kartoffelknolde. Hjemme udviklede disse kloner sig ikke kun på dyrkede kartofler, men også på vilde arter, der bar en række resistensgener; derfor var kombinationen af mange virulensgener i genomet nødvendig for at overleve under disse forhold.
Hvad angår sorter med ikke-specifik resistens, forsinker de ved at reducere patogenens reproduktionshastighed udviklingen af dens populationer, som som allerede nævnt er en funktion af antallet. Da aggressivitet er polygen, akkumuleres kloner, der indeholder et større antal gener for "aggressivitet", jo hurtigere jo højere populationsstørrelse. Derfor er meget aggressive racer ikke et produkt af tilpasning til dyrkede sorter med ikke-specifik resistens, men tværtimod er det mere sandsynligt, at de opdages i plantningerne af meget modtagelige sorter, der er akkumulatorer af parasitsporer.
Således blev i Rusland de mest aggressive populationer af P. Infestans fundet i zoner med årlige epifytotier (befolkninger fra Sakhalin, Leningrad og Bryansk regioner). Disse befolkningers aggressivitet viste sig at være højere end den mexicanske (Filippov et al., 2004).
Derudover dannes der færre oosporer i bladene af resistente sorter end i modtagelige (Hanson og Shattock, 1998), det vil sige, at den uspecifikke modstand af sorten også reducerer parasitens rekombinationsevner og muligheden for alternative overvintringsmetoder.
Indflydelse af fungicider
Fungicider reducerer ikke kun antallet af fytopatogene svampe, dvs. påvirker de kvantitative egenskaber ved deres populationer, men de kan også ændre frekvensen af individuelle genotyper, dvs. påvirke den kvalitative sammensætning af populationer. Blandt de vigtigste indikatorer for populationer, der ændrer sig under påvirkning af fungicider, er følgende: ændringer i resistens over for fungicider, ændringer i aggressivitet og virulens og ændringer i reproduktionssystemer.
Indflydelse af fungicider på resistens og aggressivitet hos populationer
Graden af denne indflydelse bestemmes først og fremmest af den anvendte type fungicid, som betinget kan opdeles i polysit, oligosit og monosit.
Førstnævnte inkluderer de fleste kontaktfungicider. Modstand mod dem (hvis det overhovedet er muligt) styres af et stort antal meget svagt udtryksfulde gener. Disse egenskaber bestemmer fraværet af synlige ændringer i resistens hos befolkningen efter behandling med fungicider (selvom der i nogle eksperimenter blev opnået en vis stigning i resistens). Svampepopulationen, der er bevaret efter sprøjtning med kontaktfungicider, består af to grupper af stammer:
1) Stammer bevaret i områder af planter, der ikke er behandlet med lægemidlet. Da der ikke var nogen kontakt med fungicidet, ændres aggressiviteten og resistensen af disse stammer ikke.
2) Stammer i kontakt med fungicidet, hvis koncentration ved kontaktpunkterne var lavere end dødelig. Som nævnt ovenfor ændres modstanden fra denne del af befolkningen heller ikke, men på grund af fungicidets delvis skadelige virkning, selv i subletal koncentration på svampecellens stofskifte, den generelle kondition og dets parasitære komponent, aggressivitet, fald (Derevyagina og Dyakov, 1990).
Således har selv en del af befolkningen, der ikke er død, udsat for kontakt med fungicidet, har en svag aggressivitet og kan ikke være en kilde til epifytotika. Derfor er omhyggelig behandling, som reducerer hyppigheden af andelen af befolkningen, der ikke er i kontakt med fungicidet, en betingelse for succes med beskyttelsesforanstaltninger. Resistens over for oligosit fungicider styres af flere additive gener.
Mutation af hvert gen fører til en vis stigning i resistens, og den samlede grad af resistens skyldes tilføjelsen af sådanne mutationer. Derfor sker stigningen i modstand trinvis. Et eksempel på en trinvis stigning i resistens er mutationer i resistens over for fungicidet dimethomorph, som i vid udstrækning bruges til at beskytte kartofler mod sen rødme. Dimethomorfbestandighed er polygen og additiv. En et-trins mutation øger modstanden let.
Hver efterfølgende mutation mindsker målstørrelsen og følgelig hyppigheden af efterfølgende mutationer (Bagirova et al., 2001). Forøgelsen i den gennemsnitlige resistens hos befolkningen efter gentagne behandlinger med oligosit fungicid forekommer trinvis og gradvist. Hastigheden af denne proces bestemmes af mindst tre faktorer: hyppigheden af mutation af resistensgener, resistenskoefficienten (forholdet mellem den dødelige dosis af en resistent stamme i forhold til en følsom) og effekten af mutationer i resistensgener på fitness.
Forekomsten af hver efterfølgende mutation er lavere end den forrige, så processen har en dæmpende karakter (Bagirova et al., 2001). Men hvis rekombinationsprocesser (seksuel eller parasexuel) forekommer i en population, er det muligt at kombinere forskellige forældrenes mutationer i en hybrid stamme og fremskynde processen. Derfor opnår panmixpopulationer hurtigere modstand end agamiske, og i sidstnævnte populationer, der ikke har vegetative inkompatibilitetsbarrierer hurtigere end populationer divideret med sådanne barrierer. I denne henseende fremskynder tilstedeværelsen af stammer i populationer, der adskiller sig i parringstyperne processen med at erhverve resistens over for oligosit-fungicider.
Den anden og tredje faktor bidrager ikke til den hurtige ophobning af dimethomorf-resistente stammer i populationer. Hver efterfølgende mutation fordobler tilnærmelsesvis modstanden, hvilket er ubetydelig og reducerer samtidig både vækstraten i et kunstigt miljø og aggressivitet (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Måske er det grunden til, at der praktisk talt ikke er nogen resistente stammer blandt naturlige P. infestans-stammer, selv de, der er opsamlet fra kartoffelplantager behandlet med dimethomorph.
En population behandlet med et oligosit fungicid vil også bestå af to grupper af stammer: dem, der ikke har været i kontakt med fungicidet og derfor ikke har ændret de oprindelige træk (hvis der findes resistente stammer blandt denne gruppe, vil de ikke akkumulere på grund af følsomme stammers højere aggressivitet og konkurrenceevne), og stammer i kontakt med subletale koncentrationer af fungicidet. Det er blandt sidstnævnte, at akkumulering af resistente stammer er mulig, fordi de her har fordele i forhold til følsomme.
Derfor, når du bruger oligosit fungicider, er det ikke så meget en grundig behandling, der er vigtig som en høj koncentration af lægemidlet, flere gange højere end den dødelige dosis, for med trinvis mutagenese er den oprindelige modstand af muterede stammer lav.
Endelig er mutationer i resistens over for monositte fungicider meget udtryksfulde, det vil sige en enkelt mutation kan rapportere et højt resistensniveau op til fuldstændigt tab af følsomhed. Derfor sker stigningen i befolkningens modstand meget hurtigt.
Et eksempel på sådanne fungicider er phenylamider, herunder det mest almindelige fungicid, metalaxyl. Mutationer af resistens over for det opstår med en høj frekvens, og modstandsgraden hos mutanter er meget høj - den overstiger den følsomme stamme med en faktor tusind eller mere (Derevyagina et al., 1993). Skønt væksthastigheden og aggressiviteten af resistente mutanter falder på baggrund af døden af modtagelige stammer fra et systemisk fungicid, vokser antallet af den resistente population hurtigt, og parallelt øges dens aggressivitet. Derfor, efter flere års brug af fungicidet, kan aggressiviteten af resistente stammer ikke kun svare til aggressiviteten hos følsomme, men også overgå den (Derevyagina og Dyakov, 1992).
Indvirkning på seksuel rekombination
Da den hyppige forekomst af A2-parringstype i P. infestans-populationer faldt sammen med den intensive brug af metalaxyl mod sen rødme, blev det foreslået, at metalaxyl inducerer parringstypekonvertering. I P. parasitica blev en sådan omdannelse under indvirkning af chloroneb og metalaxyl eksperimentelt bevist (Ko, 1994). En enkelt passage på et medium med en lav koncentration af metalaxyl førte til fremkomsten af homotalliske isolater fra en stamme af P. infestans følsomme over for metalaxyl med parringstype A1 (Savenkova og Cherepnikova-Anikina, 2002). Under efterfølgende passager på medier med en højere koncentration af metalaxyl blev der ikke påvist et enkelt isolat af A2-parringstype, men de fleste isolater, når de krydses med A2-isolater, i stedet for oosporer, dannede grimme myceliumakkumulationer og var sterile. Passager af en resistent stamme med A2-parringstype på medier med en høj koncentration af metalaxyl tillod os at detektere tre former for parringstypeændringer: 1) fuldstændig sterilitet, når de krydses med A1- og A2-isolater; 2) homotallisme (dannelsen af oosporer i monokultur); 3) konvertering af A2 parringstype til A1. Metalaxyl kan således forårsage ændringer i parringstyperne hos P. infestans-populationer og følgelig seksuel rekombination i dem.
Indflydelse på vegetativ rekombination
Nogle gener til antibiotikaresistens øgede hyphal heterokaryotisering og nuklear diploidisering (Poedinok og Dyakov, 1981). Som tidligere nævnt forekommer heterokaryotisering af hyfer under fusion af forskellige stammer af P. infestans meget sjældent på grund af fænomenet vegetativ inkompatibilitet i denne svamp. Gener for resistens over for nogle antibiotika kan imidlertid have bivirkninger, udtrykt i at overvinde vegetativ inkompatibilitet. Denne egenskab var i besiddelse af 1S-1-mutant streptomycin-resistensgenet. Tilstedeværelsen af sådanne mutanter i feltpopulationerne af phytophthora kan øge strømmen af gener mellem stammer og fremskynde tilpasningen af hele befolkningen til nye sorter eller fungicider.
Visse fungicider og antibiotika kan påvirke hyppigheden af mitotisk rekombination, hvilket også kan ændre genotypefrekvenser i populationer. Det udbredte fungicidbenomyl binder til beta-tubulin, et protein, hvorfra mikrotubuli i cytoskeletet bygges, og derved forstyrrer kromosomseparationsprocesserne i mitafas anafase, hvilket øger hyppigheden af mitotisk rekombination (Hastie, 1970).
Fungicidet para-fluorphenylalanin, der anvendes til behandling af hollandsk sygdom hos alm, har den samme egenskab. Para-fluorphenylalanin øgede hyppigheden af rekombination i heterozygote diploider P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cykliske ændringer i den genotypiske sammensætning af populationer i P. infestans livscyklus
Den klassiske udviklingscyklus af P. infestans i den tempererede zone består af 4 faser.
1) Fase med eksponentiel vækst i befolkningen (polycyklisk fase) med korte generationer. Denne fase begynder normalt i juli og varer 1,5-2 måneder.
2) Fasen med at stoppe befolkningens vækst på grund af et kraftigt fald i andelen af upåvirket væv eller indtræden af ugunstige vejrforhold. Denne fase i gårde, der udfører tidlig fjernelse af blade, falder ud af den årlige cyklus.
3) Overvintringsfasen i knolde ledsaget af et signifikant fald i befolkningsstørrelsen på grund af utilsigtet infektion af knolde, langsom udvikling af infektion i dem, fraværet af reinfektion af knolde, rådnende og slagtning af berørte knolde under normale opbevaringsforhold.
4) Fasen med langsom udvikling i jord og på kimplanter (monocyklisk fase), hvor produktionsvarigheden kan nå en måned eller mere (sidst i maj - begyndelsen af juli). Normalt på dette tidspunkt er syge blade vanskelige at opdage, selv med specielle observationer.
Fase med eksponentiel befolkningsvækst (polycyklisk fase)
Talrige observationer (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) viste, at i begyndelsen af epifytotisk dominerer lavvirulente og let aggressive kloner, som efterfølgende erstattes af mere virulente og aggressive. vækstraten for befolkningens aggressivitet er jo højere, jo mindre resistent er værtsplantens sort.
Efterhånden som befolkningen vokser, øges koncentrationen af både selektivt vigtige gener indført i kommercielle sorter (R1-R4) og selektivt neutral (R5-R11). I befolkningerne nær Moskva i 1993 steg den gennemsnitlige virulens fra slutningen af juli til midten af august fra 8,2 til 9,4, og den største stigning blev observeret for det selektivt neutrale virulensgen R5 (fra 31 til 86% af virulente kloner) (Smirnov, 1996 ).
Et fald i befolkningens vækstrate ledsages af et fald i befolkningens parasitiske aktivitet. Derfor er både det samlede antal løb og andelen af meget virulente løb i depressive år lavere end i epifytotiske racer (Borisenok, 1969). Hvis i højden af epifytotiske vejrforhold skifter til ugunstig for sen rødme, og kartoffelangreb falder, falder også koncentrationen af stærkt virulente og aggressive kloner (Rybakova et al., 1987).
Stigningen i hyppigheden af gener, der påvirker populationens virulens og aggressivitet, kan skyldes udvælgelsen af mere virulente og aggressive kloner i den blandede population. For at demonstrere selektionen blev der udviklet en metode til analyse af neutrale mutationer, som blev anvendt med succes i kemostatpopulationer af gær (Adams et al., 1985) og Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Hyppigheden af mutanter, der er resistente over for blasticidin S i feltpopulationen af P. infestans, faldt parallelt med væksten i befolkningens aggressivitet, hvilket indikerer en ændring i de dominerende kloner under befolkningens vækst (Rybakova et al., 1987).
Vinterfase i knolde
Under overvintring i kartoffelknolde falder virulens og aggressivitet af P. infestans stammer, og faldet i virulens forekommer langsommere end aggressivitet (Rybakova og Dyakov, 1990). Under betingelser, der fremmer den hurtige vækst af befolkningen (r-selektion), er tilsyneladende "ekstra" virulensgener og høj aggressivitet nyttige, derfor er udviklingen af epifytotika ledsaget af udvælgelsen af de mest virulente og aggressive kloner. Under betingelser for mætning af miljøet, når ikke reproduktionshastigheden, men vedvarende eksistens under ugunstige forhold (K-selektion) spiller en vigtig rolle, "ekstra" gener af virulens og aggressivitet reducerer fitness, og kloner med disse gener er de første til at dø ud, så den gennemsnitlige aggressivitet og befolkningens virulens falder.
Vegetationsfase i jord
Denne fase er den mest mystiske i livscyklussen (Andrivon, 1995). Dens eksistens blev postuleret rent spekulativt - på grund af manglen på information om, hvad der sker med patogenet over en lang periode (undertiden mere end en måned) - fra fremkomsten af kartoffelplanter til udseendet af de første pletter af sygdommen på dem. På baggrund af observationer og eksperimenter blev svampens opførsel i denne livsperiode rekonstrueret (Hirst og Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulation af svampen kan dannes på inficerede knolde i jorden. De resulterende sporer spirer med hyfer, som kan vegetere i lang tid i jorden. Primære (dannet på knolde) og sekundære (på myceliet i jorden) sporer stiger op til jordoverfladen ved kapillærstrømme, men får først evnen til at inficere kartofler, når de nederste blade falder ned og kommer i kontakt med jordoverfladen. Sådanne blade (nemlig de første pletter af sygdommen findes på dem) dannes ikke med det samme, men efter langvarig vækst og udvikling af kartoffeltoppe.
Således kan den saprotrofiske vegetationsfase også eksistere i P. infestans livscyklus. Hvis aggressivitet er den vigtigste komponent i fitness i den parasitiske fase af livscyklussen, er selektion i den saprotrofiske fase rettet mod at reducere de parasitære egenskaber, som det er vist eksperimentelt for nogle fytopatogene svampe (se Carson, 1993). Derfor bør aggressive egenskaber i denne fase af cyklussen gå tabt mest intensivt. Men indtil videre er der ikke udført nogen direkte eksperimenter for at bekræfte ovenstående antagelser.
Sæsonbestemte ændringer påvirker ikke kun de patogene egenskaber af P. infestans, men også modstandsdygtigheden over for fungicider, der vokser i den polycykliske fase (under epifytotier) og falder under vinteropbevaring (Derevyagina et al., 1991; Kadish og Cohen, 1992). Et særligt intensivt fald i resistens over for metalaxyl blev observeret i perioden mellem plantningen af de berørte knolde og fremkomsten af de første pletter af sygdommen i marken.
Intraspecifik specialisering og dens udvikling
P. infestans forårsager epidemier i to kommercielt vigtige afgrøder, kartofler og tomat. Epifytotier på kartofler begyndte kort efter, at svampen kom ind i nye områder. Tomats nederlag blev også bemærket kort efter forekomsten af infektion på kartofler, men epifytotier på tomat blev kun bemærket hundrede år senere - i midten af det XNUMX. århundrede. Her er hvad Hallegli og Niederhauser skriver om tomats nederlag i USA
(1962): ”I omkring 100 år efter den alvorlige epifytoty i 1845 blev der gjort få eller næsten ingen forsøg på at opnå resistente tomatsorter. Selvom sen rødme først blev registreret på tomater så tidligt som i 1848, blev det ikke genstand for opdrætters alvorlige opmærksomhed på denne plante før et stærkt udbrud af sygdommen i 1946. På Ruslands område blev der registreret sen tomatskimmel i det 60. århundrede. ”I lang tid var forskerne ikke opmærksomme på denne sygdom, da den ikke forårsagede væsentlig økonomisk skade. Men i 70'erne og 1979'erne. XX-århundredes epifytotier af sen rødme på tomat observeres også i Sovjetunionen, hovedsageligt i Nedre Volga-regionen, i Ukraine, Nordkaukasus, i Moldova ... ”(Balashova, XNUMX).
Siden da er tomatblødning ved senblødning blevet årlig, spredt over hele det industrielle og hjemmearbejdende område og forårsager enorm økonomisk skade på denne afgrøde. Hvad skete der? Hvorfor opstod parasitens første udseende på kartofler og den epifytotiske læsion af denne kultur næsten samtidigt, mens det tog et århundrede, før epifytotisk sygdom kom til syne på tomat? Disse forskelle understøtter en mexicansk snarere end en sydamerikansk kilde til infektion. Hvis arten Phytophthora infestans dannes som en parasit af mexicanske knoldbærende arter af slægten Solanum, er det forståeligt, hvorfor den dyrkede kartoffel, der tilhører den samme sektion af slægten som den mexicanske art, blev så stærkt påvirket, men på grund af fraværet af co-evolution med parasitten, som ikke udviklede mekanismer for specifik og ikke-specifik resistens.
Tomaten hører til en anden sektion af slægten, dens udveksling har betydelige forskelle fra den knoldrige art, på trods af at tomaten ikke er uden for fødevarespecialiseringen af P. infestans, var dens nederlags intensitet utilstrækkelig til alvorlige økonomiske tab.
Fremkomsten af epifytotier på en tomat skyldes alvorlige genetiske ændringer i parasitten, hvilket øgede dens kondition (patogenicitet) under parasitisme. Vi mener, at den nye form, der er specialiseret til parasitisering af tomaten, er T1-løbet beskrevet af M. Gallegly, der påvirker sorter af cherrytomat (Red Cherry, Ottawa), der er resistent over for T0-racen, der er udbredt på kartofler (Gallegly, 1952). Tilsyneladende var en mutation (eller en række mutationer), der gjorde T0-løbet til T1-løbet og førte til fremkomsten af kloner, der var meget tilpasset til at besejre tomat. Som det ofte sker, blev en stigning i patogenicitet for en vært ledsaget af et fald i den til en anden, det vil sige, der opstod en indledende, endnu ikke komplet intraspecifik specialisering - til kartofler (race T0) og til tomat (race T1).
Hvad er beviset for denne antagelse?
- Forekomst på kartofler og tomater. På tomatblade dominerer T1-løbet, mens det på kartoffelblade er sjældent. Ifølge S.F. Bagirova og T.A. Oreshonkova (upubliceret) i Moskva-regionen i 1991-1992 var forekomsten af T1-løbet i kartoffelplantager 0% og i tomatplantager - 100%; i 1993-1995 - henholdsvis 33% og 90%; i 2001 - 0% og 67%. Lignende data blev opnået i Israel (Cohen, 2002). Eksperimenter med infektion af kartoffelknolde med isolater fra T1-løbet og en blanding af isolater T0 og T1 viste, at isolater fra T1-løbet er dårligt bevarede i knolde og erstattes af isolater fra T0-løbet (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamik af race T1 i tomatplantager. Den primære infektion af tomatblade udføres af isolater fra T0-løbet, der dominerer i analysen af infektion i de første pletter dannet på bladene. Dette bekræfter den generelt accepterede ordning for parasitmigrationen: Hovedmassen af infektion fra kartofler består af T0-løbet, men et lille antal T1-kloner, der er bevaret i kartofler, en gang på tomat, fortrænger T0-løbet og akkumuleres mod slutningen af den epifytotiske periode. Det er også muligt, at der er en alternativ kilde til infektion af tomatblade med T1-løbet, ikke så kraftig som kartoffelknolde og blade, men konstant. Derfor har denne kilde en svag effekt på den genetiske struktur af befolkningen, der inficerer tomat, men bestemmer efterfølgende akkumuleringen af T1-løbet (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Aggressivitet over for kartofler og tomater. Kunstig infektion af tomat- og kartoffelblade med isolater fra løb T0 og T1 viste, at førstnævnte er mere aggressive over for kartofler end for tomat, og sidstnævnte er mere aggressive for tomat end for kartoffel. Disse forskelle manifesteres i forskydningen af isolater fra en ikke- "egen" race fra en blandet befolkning under passager på blade i et drivhus (Dyakov et al., 1975) og i markplotter (Leberton et al., 1999); forskelle i den minimale infektiøse belastning, latensperiode, størrelse på infektiøse pletter og sporproduktion (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Aggressiviteten af isolater fra T1-løbet over for tomatkultivarer, der mangler resistensgener, er så høj, at disse isolater sporer på blade som på et næringsmedium uden nekrotisering af det inficerede væv (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulens for kartofler og tomater. T1-løbet påvirker cherrytomatvarianter med Ph1-resistensgenet, mens T0-løbet ikke er i stand til at inficere disse sorter, dvs. har en smallere virulens. I forhold til differentiatorer
Kartoffels R-gener er omvendt beslægtede, dvs. stammer isoleret fra tomatblade er mindre virulente end "kartoffel" -stammer (tabel 11).
5) Neutrale markører. Analysen af neutrale markører i populationerne af P. infestans, der parasiterer på kartofler og tomater, vidner også om det multidirektionelle intraspecifikke valg. I de brasilianske populationer af P. infestans tilhørte tomatbladisolater den klonale linje US-1, og de fra kartoffelblade tilhørte BR-1-linjen (Suassuna et al., 2004). I Florida (USA) begyndte klon US-1994 siden 90 at dominere på kartofler (med en forekomst på mere end 8%) og kloner US-11 og US-17 på tomat, og sidstnævntes isolater er mere aggressive over for tomat end for kartoffel (Weingartner , Tombolato, 2004). Væsentlige forskelle i genotypefrekvenser (DNA-fingeraftryk) i kartoffel- og tomatisolater blev etableret for 1200 P. infestans-stammer opsamlet i USA fra 1989 til 1995 (Deahl et al., 1995).
Ved hjælp af AFLP-metoden blev det muligt at adskille 74 stammer opsamlet fra kartoffel- og tomatblade i 1996-1997. i Frankrig og Schweiz i 7 grupper. Kartoffel- og tomatstammerne afveg ikke tydeligt, men "kartoffel" -stammerne var genetisk mere forskellige end de "tomatiske". Førstnævnte blev fundet i alle syv klynger, og sidstnævnte kun i fire, hvilket indikerer et mere specialiseret genom af sidstnævnte (Knapova og Gisi, 2002).
6) Isolationsmekanismer. Hvis populationen af parasitten på to værtsplantearter udvikler sig mod indsnævring af specialisering mod deres “egen” vært, så opstår forskellige præ- og postmeiotiske mekanismer, der forhindrer interpopulation genetisk udveksling (Dyakov og Lekomtseva, 1984).
Flere studier har undersøgt virkningen af kilden til forældrestammer på effektiviteten af hybridisering. Når stammer isoleret fra forskellige arter af slægten Solanum blev krydset i Ecuador (Oliva et al., 2002), viste det sig, at stammer med A2-parringstypen fra vilde natskygger (klonlinie EC-2) krydsede det værste med stammer fra tomat (linje EC -3) og krydses mest effektivt med kartoffelstammen (EC-1).
Alle hybrider viste sig at være ikke-patogene. Forfatterne mener, at den lave procentdel af hybridisering og reduktion af patogenicitet i hybrider skyldes postmeiotiske mekanismer til reproduktiv isolering af populationer.
I eksperimenterne fra Bagirova et al. (1998) blev et stort antal kartoffel- og tomatstammer krydset med egenskaberne ved T0- og T1-løbene. De mest frugtbare var krydsninger af T1xT1-stammer isoleret fra tomat (36 oosporer i mikroskopets synsfelt, 44% af oospore-spiring), den mindst effektive var krydsninger af T0xT1-løb isoleret fra forskellige værter (et lavt antal udviklende og spirede oosporer, en høj andel af abortive og underudviklede oosporer) ... Effektiviteten af krydsninger mellem isolater fra T0-løbet isoleret fra kartofler var mellemliggende. Da hoveddelen af stammer fra T0-løbet påvirker kartofler, har den en pålidelig kilde til overvintring - kartoffelknolde, hvilket betyder, at oosporernes betydning som overvintrende smitsomme enheder for populationer fra kartofler er lav. Den tilpassede "tomatform" er i stand til at overvintre på tomaten i form af oosporer (se nedenfor) og bevarer derfor en højere produktivitet i den seksuelle proces. På grund af sin høje fertilitet får T1 et uafhængigt potentiale for primær infektion i tomat. Resultaterne opnået af Knapova et al. (Knapova et al., 2002) kan fortolkes på samme måde. Kryds af stammer isoleret fra kartofler med stammer fra tomat gav det højeste antal oosporer - 13,8 pr. Kvm. Mm. medium (med et spredning på 5-19) og en mellemliggende procentdel af spiring af oosporer (6,3 med et spredning på 0-24). Krydsninger af stammer isoleret fra tomat gav den laveste procentdel af oosporer (7,6 med et spredning på 4-12) med den højeste procentdel af deres spiring (10,8). Krydsningerne mellem stammerne isoleret fra kartofler gav et mellemliggende antal oosporer (8,6 med en høj spredning af data - 0-30) og den laveste procentdel af spiring af oosporer (2,7). Således er stammer fra kartofler mindre frugtbare end dem fra tomat, men interpopulationskryds gav ikke dårligere resultater end intrapopulation. Det er muligt, at forskellene med ovenstående data af Bagirova et al. forklares ved, at russiske forskere arbejdede med stammer isoleret i begyndelsen af 90'erne af det 90. århundrede, og schweiziske forskere - med stammer isoleret i slutningen af XNUMX'erne.
Grundlaget for lav fertilitet kan være heteroploidien af stammerne. Hvis i mexicanske befolkninger, hvor den seksuelle proces og primære infektion med oosporøse afkom er regelmæssige, observeres de fleste af de undersøgte stammer af P. Infestans diploide, så observeres der i landene i den gamle verden intrapopulation polymorfisme af ploidi (di-, tri- og tetraploide stammer såvel som heterokaryote stammer med heteroploide kerner) og stammer med forskellige typer parring, dvs. gensidigt frugtbar, adskiller sig i nuklear ploidi (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Mangfoldighed af kerner i antheridia og oogonia kan være årsagen til lav fertilitet.
Hvad angår nuklear udveksling mellem hyfer under anastomoser, forhindres dette af vegetativ inkompatibilitet, som opdeler aseksuelle populationer i mange genetisk isolerede kloner (Poedinok og Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergens af populationer. Ovenstående data indikerer, at hybridisering mellem "kartoffel" og "tomat" P. infestans stammer er mulig. Gensidig geninfektion af forskellige værter er også mulig, omend med nedsat aggressivitet.
En undersøgelse af populationsmarkører i isolater fra tilstødende kartoffel- og tomatmarker i 1993 viste, at ca. en fjerdedel af isolaterne isoleret fra tomatblade blev overført fra en nærliggende kartoffelmark (Dolgova et al., 1997). Teoretisk kunne det antages, at afvigelsen af populationer på to værter ville øges og føre til fremkomsten af specialiserede intraspecifikke former (f.sp. kartoffel og f.sp. tomat), især da oosporer kan fortsætte i planterester (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) og tomatfrø (Rubin et al., 2001). Derfor har tomater i øjeblikket en kilde til foråret regenerering uafhængig af kartoffelknolde.
Men alt skete forskelligt. Overvintring med oosporer tillod parasitten at undgå det smaleste trin i sin livscyklus - det monocykliske vegetationsstadium i jorden, hvor parasitiske egenskaber falder, som gradvist gendannes i den polycykliske fase om sommeren.
Tabel 11. Frekvenser af virulensgener til kartoffeldifferentieringssorter i P. infestans-stammer
Land | År | Gennemsnitligt antal virulensgener i stammer | Forfatter | |
fra kartofler | fra tomat | |||
Frankrig | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Frankrig, Schweiz | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
USA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusland, Mosk. område | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusland, forskellige regioner | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya og andre. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primær zoosporangia og zoosporer, der spirer oosporer, har en høj grad af parasitisk aktivitet, især hvis oosporerne blev dannet parthenogenetisk under påvirkning af feromoner af en stamme med den modsatte type parring. Derfor er det infektiøse materiale på tomatplanter dyrket af frø inficeret med oosporer meget patogent for både tomat og kartoffel.
Disse ændringer førte til en anden omstrukturering af befolkningen, udtrykt i følgende vigtige ændringer fra et epidemiologisk synspunkt:
- Inficerede tomatplanter er blevet en vigtig kilde til primær infektion af kartofler (Filippov, Ivanyuk, personlige beskeder).
- Epifytotier på kartofler begyndte at blive observeret så tidligt som i juni, omkring en måned tidligere end normalt.
- I kartoffelplantager steg procentdelen af T1-løbet, hvilket man tidligere oplevede i en ubetydelig mængde (Ulanova et al., 2003).
- Stammer isoleret fra tomatblade ophørte med at adskille sig fra kartoffelstammer i virulens på kartoffeldifferentiatorer af virulensgener og begyndte at overgå "kartoffel" -stammer i aggressivitet ikke kun på tomat, men også på kartofler (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
I stedet for divergens var der således en konvergens af populationer, fremkomsten af en enkelt population på to værtsplanter med høj virulens og aggressivitet over for begge arter.
Konklusion
Så på trods af mere end 150 års intensiv undersøgelse af P. infestans, i biologi, inklusive befolkningsbiologien af dette forårsagende middel til de vigtigste sygdomme hos dyrkede solanaceous planter, er meget stadig ukendt. Det er ikke klart, hvordan passagen af individuelle stadier af livscyklussen påvirker befolkningens struktur, hvad er de genetiske mekanismer for den kanaliserede variabilitet af aggressivitet og virulens, hvad er forholdet mellem reproduktive og klonale reproduktionssystemer i naturlige populationer, hvordan vegetativ inkompatibilitet arves, hvad er kartoffelens og tomatens rolle i den primære infektion af disse afgrøder og i hvad er deres virkning på strukturen af parasitpopulationer. Indtil videre er sådanne vigtige praktiske spørgsmål som de genetiske mekanismer til ændring af parasitens aggressivitet eller erosion af uspecifik kartoffelresistens ikke løst. Med uddybningen og udvidelsen af forskningen om kartoffel sen rødme udgør parasitten nye udfordringer for forskere. Imidlertid giver forbedringen af eksperimentelle kapaciteter, fremkomsten af nye metodologiske tilgange til manipulation af gener og proteiner os til at håbe på en vellykket løsning på de stillede spørgsmål.
Artiklen blev offentliggjort i tidsskriftet "Potato Protection" (nr. 3, 2017)