SPISE. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Det er for nylig blevet vist, at ascomycete-svampen Ilyonectria crassa er i stand til at inficere kartoffelknolde. Dette arbejde er det første til at analysere de biologiske egenskaber og modstandsdygtighed over for nogle fungicider af I. crassa stammen isoleret fra kartofler. Sekvenserne af artsspecifikke regioner af "kartoffel" stammen faldt sammen med dem, der blev opnået tidligere for svampe isoleret fra påskeliljer, ginseng, asp og bøg, liljepærer og tulipanblade. Tilsyneladende kan mange vilde planter og haveplanter være reserver af I. crassa. Den undersøgte stamme inficerede tomat- og kartoffelskiver, men inficerede ikke hele tomatfrugten og den intakte kartoffelknold. Dette viser, at I. crassa er en sårparasit. Evaluering af resistens over for fludioxonil, difenoconazol og azoxystrobin på et næringsmedium viste høj effekt af disse lægemidler.
EC50-indekset (koncentrationen af fungicidet, som sænkes 2 gange hastigheden af koloniens radiale vækst i forhold til den fungicid kontrol) var lig med 0.4; 7.4 og 4 mg / l henholdsvis. Muligheden for udvikling af sygdommen forårsaget af I. crassa bør tages i betragtning ved fytopatologisk vurdering af kartoffelknolde og udviklingen af plantebeskyttelsesforanstaltninger.
Udviklingen af fytopatogene mikroorganismer fører til høje tab i alle faser af dyrkning og opbevaring af kartofler. Ved planlægning af beskyttelsesforanstaltninger tages der som regel hensyn til kendte patogener såsom arter af slægterne Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora osv. Imidlertid har der i de senere år været flere og flere rapporter om udseendet af nye fytopatogene mikroorganismer på kartofler. Deres biologi er dårligt undersøgt, effektiviteten af fungicider, der anvendes på kartofler i forhold til dem, er ukendt, diagnostiske metoder er ikke blevet udviklet. Med masseudvikling er de i stand til at forårsage betydelig skade på kartoffelafgrøden. En af disse mikroorganismer er ascomycete-svampen Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, først opdaget af forfatterne på kartoffelknolde (Chudinova et al., 2019).
Dette arbejde præsenterer resultaterne af analysen af I. crassa stammen isoleret fra kartoffelknolde. Morfologien for kolonier og myceliale strukturer af I. crassa, nukleotidsekvenser for artsspecifikke DNA-regioner, virulens over for kartofler og tomater og resistens over for nogle populære fungicider blev undersøgt.
Materialer og metoder
Vi brugte I. crassa 18KSuPT2 stammen isoleret i 2018 fra den inficerede kartoffelknold dyrket i Kostroma-regionen. Knolden blev påvirket af en tør rådnetype med et hulrum dækket med lysebrunt mycelium. Ved anvendelse af en steril dissektionsnål blev svampemyceliet overført til en petriskål med et agarmedium (ølurt 10%, agar 1.5%, penicillin 1000 U / ml). Pladerne blev inkuberet i mørke ved 24 ° C.
Et Leica DM2500-lysmikroskop med et ICC50 HD digitalt kamera og et Leica M80 binokulært mikroskop med et IC80HD digitalt kamera (Leica Microsystems, Tyskland) blev brugt til at fotografere, vurdere størrelsen og morfologien af sporer og spororganer.
For at isolere DNA blev svampemyceliet dyrket i flydende ærtemedium, derefter frosset i flydende nitrogen, homogeniseret, inkuberet i CTAB-puffer, oprenset med chloroform og vasket to gange med 2% alkohol.
DNA-ekstraktionsmetoden er beskrevet detaljeret i artiklen af Kutuzova et al. (2017).
For at bestemme arten ved molekylære metoder og sammenligne med andre kendte I. crassa-stammer blev PCR udført med primere, der tillod amplifikation af artsspecifikke DNA-regioner: ITS1-5,8S-ITS2 (primere ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genregioner b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) og translation forlængelsesfaktor 1a (tef1a) (primere EF1-728F / EF1-986R, Carbone og Kohn, 1999). Amplikoner med den ønskede længde blev ekstraheret fra gelen ved hjælp af Evrogen CleanUp-kittet. De amplificerede regioner blev sekventeret ved anvendelse af BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) på en Applied Biosystems 3730 xl automatiseret sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). De opnåede nukleotidsekvenser blev brugt til at søge efter et match i GenBank-databasen fra US National Center for Biotechnology Information (NCBI). Fylogenetisk analyse blev udført ved hjælp af MEGA 6-programmet (Tamura et al., 2013).
Bestemmelse af virulens blev udført på hele grønne frugter af storfrugtet tomat (Dubrava-sort) og kartoffelknolde (Gala-sort). For at simulere beskadigelse af beskadigede frugter og knolde brugte vi desuden skiver af de samme frugter og knolde. Skiver af knolde blev anbragt i fugtige kamre, som var petriskåle med vådt filterpapir i bunden. Der blev anbragt et dias på papiret, hvorpå der blev skåret knolde eller frugter. Hele knolde og frugter blev også anbragt i beholdere med vådt filterpapir i bunden. I midten af skiven (eller på den intakte overflade af knolden eller frugten) blev et stykke agar (5 × 5 mm) med svampehyfer placeret efter 5 dages dyrkning på urtagar.
Vurderingen af svampestammernes resistens over for fungicider blev udført under laboratorieforhold på agar næringsmedium. Vi studerede følsomheden over for fungicidlægemidler Maxim, KS (aktiv ingrediens fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (Statskatalog ..., 2020). Evaluering blev udført i petriskåle på urtagarmedium med tilsætning af de undersøgte lægemidler i koncentrationer af det aktive stof 0.1; en; 1 ppm (mg / l) (for fludioxonil og difenoconazol), 10; ti; 1 ppm (for azoxystrobin) og i medier uden fungicid (kontrol). Fungicidet blev tilsat til det smeltede og afkølet til 10 ° C medium, hvorefter mediet blev hældt i petriskåle. En agarblok med svampemycelium blev anbragt i midten af en petriskål og dyrket ved en temperatur på 100 ° C i mørke. Efter 60 dages inkubation blev kolonienes diameter målt i to indbyrdes vinkelrette retninger; måleresultaterne for hver koloni blev gennemsnittet. Eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer. Baseret på resultaterne af analyserne blev EC24 beregnet svarende til koncentrationen af fungicidet, som halverede koloniens radiale vækst i forhold til den fungicid kontrol.
Resultater og diskussion
På petriskåle med urtagar dannede svampen kolonier med hvidt flokkulært mycelium. Mediet under myceliet blev rødbrunt. Når mediet tørrer op, dannede svampen sporer af to typer på enkelt og aggregerede konidioforer i lille sporodochia. Makrokonidier er aflange, cylindriske med en til tre septa, gennemsnitlig længde 27.2 µm med et interval af værdier fra 23.2 til 32.2 µm, bredde - op til 4.9 µm (fig. 1). Den gennemsnitlige længde af mikrokonidier er 14.3 µm med et interval af værdier fra 10.3 til 18.1 µm, bredden er op til 4.0 µm. Alle makro- og mikromorfologiske tegn passer ind i variationen af arten Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekvenserne af artsspecifikke DNA-regioner (ITS, b-tubulin, TEF 1α) faldt fuldstændigt sammen med sekvenserne af I. crassa-stammerne, vi studerede tidligere (Chudinova et al., 2019, tabel 1). For at undersøge forekomsten af I. crassa i andre regioner og for at analysere spektret af berørte kulturer blev analoge DNA-sekvenser i GenBank-databasen analyseret (tabel 1). Overlappingen var 86 til 100%. Sekvenserne af alle tre DNA-regioner af "kartoffel" I. crassa-stammen var identiske med sekvenserne for stammerne isoleret fra liljepæren og narcissusrødderne i Holland og fra ginsengroden i Canada. Vi kunne ikke finde andre I. crassa-stammer med tre analyserede lignende sekvenser i åbne databaser. Analyse af de deponerede ITS- og b-tubulinsekvenser viste imidlertid tilstedeværelsen af I. crassa på tulipanblade i Storbritannien. Svampe med en lignende ITS-sekvens blev identificeret i analysen af mycobiota af asprødder i Canada og bøgrødder i Italien, kartoffelknolde i Saudi-Arabien (tabel 1). Resultaterne af denne undersøgelse viser, at I. crassa har en global distribution og er i stand til at inficere forskellige plantearter.
Ved bestemmelse af patogeniciteten på skiver af tomat og kartoffel den 5. dag nåede læsionens diameter 1.5 cm. Den undersøgte stamme inficerede ikke hele tomatfrugten og den intakte kartoffelknold. Imidlertid blev bægerbladene påvirket af tomaten. For at udelukke muligheden for forurening blev et svampeisolat fra myceliet udviklet på en kartoffelknoldskive isoleret i en ren kultur. Det var helt identisk med forældrenes belastning. I. crassa er tilsyneladende en sårparasit.
Forplantning af frøknolde med fungicider reducerer udviklingen af sygdomme på planter i vækstsæsonen. Til udvælgelsen af effektive fungicider er det vigtigt at vurdere, hvilke af dem der er effektive mod I. сrassa. Arbejdet undersøgte de udbredte aktive stoffer i fungicider - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazol. Fludioxonil er inkluderet i flere blandinger, der anvendes til dressing af frø og frøknolde inden plantning. Fludioxonil (Maxim) bruges også til behandling af frøknolde inden opbevaring. Difenoconazol og azoxystrobin er også inkluderet i en række præparater, der anvendes til forarbejdning af frømateriale såvel som i præparater beregnet til behandling af vegetative planter (Statskatalog ..., 2020).
Væksthastigheden af I. crassa blev undersøgt på medier (fig. 2) med forskellige koncentrationer af aktive stoffer: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) og difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabel 2). Disse præparater kan betragtes som meget effektive mod I. crassa, da deres EC50 er signifikant lavere end den anbefalede koncentration af præparatet i arbejdsfluidet, der anvendes til behandling af knolde. Ifølge statskataloget ... (2020) er koncentrationen af fludioxonil i væsken til behandling af kartoffelknolde fra 500 til 1000 ppm, azoxystrobin (i væsken til behandling af bunden af furen) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (i væsken til behandling af vegetative planter) - 187.5– 625 ppm.
Tabel 1. Lighed mellem sekvenser af artsspecifikke sekvenser af stamme 18KSuPT2 og stammer af Ilyonectria crassa tilgængelige i Genbank-databasen
Stamme | Værtsplante, udskillelsessted | Sekvensnumre deponeret i GenBank, procentdel af ligheder | Link | ||
ITS | β-tubulin | TEF la | |||
17KSPT1 og 18KSuPT2 | Kartoffelknold, Kostroma-regionen | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, dette arbejde |
CBS 158/31 | Narcissus rødder, Holland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Liljepære, Holland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng rod, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulipanblad, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen rødder, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Bøg, Italien | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direkte indsendelse |
KAUF19 | Kartoffelknold, Saudi-Arabien | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ikke deponeret
Tabel 2. Resistens af Ilyonectria crassa over for fungicider
(aktivt stof) | EC50, ppm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Kontrol | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
I vores arbejde blev I. crassa stammer isoleret fra kartoffelknolde i regionerne Kostroma og Moskva (Chudinova et al., 2019). En høj andel svampestammer med ITS-sekvenser identiske med I. crassa blev afsløret ved analyse af mycobiota af kartoffelknolde i Saudi-Arabien (Gashgari og Gherbawy, 2013). I. crassa er tilsyneladende ikke så sjælden på kartofler, som det kan synes. Vores eksperimenter viste, at svampen kunne inficere beskadigede tomatfrugter. Det er kendt fra litteraturen, at I. crassa er i stand til at udvikle sig i jorden saprotrofisk (Moll et al., 2016) såvel som at påvirke en række planter, selv taksonomisk fjerne, såsom påskeliljer, liljer, ginseng, asp og bøg (tabel 1). en). Tilsyneladende kan mange vilde planter og haveplanter være reserver af I. crassa. Ovenstående viser, at når der udvikles beskyttelsesforanstaltninger, er det nødvendigt at tage højde for muligheden for at påvirke kartoffelknolde med denne svamp. Udbredte præparater til behandling af kartoffelknolde indeholdende fludioxonil, azoxystrobin og difenoconazol har vist høj fungicid virkning mod I. crassa.
Dette arbejde blev støttet af den russiske fond for grundforskning (tilskud nr. 20-016-00139).
Artiklen blev offentliggjort i tidsskriftet "Plantebeskyttelsesbulletin", 2020, 103 (3)