D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Den fytopatogene svamp Colletotrichum coccodes forårsager farlige sygdomme i kartofler og tomater kendt som anthracnose og sort knold. Af morfologiske egenskaber er de ofte vanskelige at skelne fra sygdomme forårsaget af andre mikroorganismer; på grønne tomatfrugter kan sygdommen være asymptomatisk og kun manifestere sig på modne røde frugter. Til hurtig og nøjagtig diagnose af patogenet tilbydes et PCR-testsystem i realtid. For at udvikle et testsystem blev nukleotidsekvensen af glyceroltriphosphatdehydrogenasegenet fra 45 ° C bestemt. Coccodes stammer isoleret fra kartoffelknolde i forskellige regioner i Rusland.
Baseret på de opnåede resultater og analyse af lignende sekvenser af andre arter, der er tilgængelige i GenBank-databasen, blev artsspecifikke primere og probe til C. coccodes designet. For at teste specificiteten af det oprettede testsystem blev PCR udført med DNA isoleret fra rene kulturer af 15 forskellige arter af parasitiske og saprotrofiske svampe associeret med tomat- og kartoffelplanter (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Tilstedeværelsen af Colletotrichum coccodes DNA blev bestemt ved en tærskelcyklus på 20-27, mens andre arter blev påvist efter 40 cyklusser eller ikke blev detekteret. Testsystemet gør det muligt pålideligt at detektere C. coccodes DNA-koncentrationer på over 0.01 ng / mm3 i den analyserede PCR-blanding. Ved hjælp af det udviklede testsystem blev tilstedeværelsen af C. coccodes i tomatblade med symptomer på svampesygdomme og i kartoffelknolde uden eksterne symptomer på sygdommen undersøgt. Blade med symptomer på svampeinfektion blev opsamlet fra to forskellige felter i Krasnodar-territoriet, knolde - fra marker i Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod-regionerne. Et tomatblad indeholdende C. coccodes DNA blev fundet i Krasnodar-territoriet; den signifikante tilstedeværelse af DNA fra dette patogen blev påvist i 5 prøver af knolde dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionerne.
Indledning
Svampe af slægten Colletotrichum er farlige fytopatogener, der påvirker korn, grøntsager, urter, flerårig frugt og bærplanter. En af de allestedsnærværende arter af denne slægt, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, er det forårsagende middel til antracnose og sort plet af kartofler og tomater og forårsager sygdomme i en række andre planter af Solanaceae-familien, inkl. ukrudt (Dillard, 1992). C. coccodes inficerer alle underjordiske dele af planten, stammebaser, blade og frugter (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). På skræl af inficerede kartoffelknolde observeres udviklingen af grå pletter med utydeligt udprægede kanter, hvorpå sorte prikker af sporulation og mikrosklerotier er tydeligt synlige. Under opbevaring kan sår med blødgjort indhold dannes i knoldmasse, dvs. sygdommen går ind i antracnose-fasen, som imidlertid er yderst sjælden.
Samtidig er symptomerne på antracnose (hudsår med små sorte prikker) typiske på tomatfrugter. På blade vises symptomerne på C. coccodes som mørkebrune pletter, som regel grænser op til gult væv (Johnson, 1994).
Udviklingen af sort plet på knoldene ødelægger deres udseende, hvilket især er markant, når der sælges vaskede rødskalede kartofler. Peel peeling fører til overskydende fordampning og øgede lagertab (Hunger, McIntyre, 1979). Skader på andre planteorganer fører til udbyttetab, hvilket blev bemærket i både åben og lukket grund (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Sygdomme forårsaget af C. coccodes er almindelige i næsten alle kartoffelproducerende regioner i verden, inklusive Rusland (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrol af disse sygdomme er vanskelig på grund af utilstrækkelig effektivitet af eksisterende fungicider mod C. coccodes og manglen på resistente sorter (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inokulum kan vedblive i frøknolde (Læs, Skjul, 1988; Johnson et al., 1997), tomatfrø (Ben-Daniel et al., 2010), overleve i lang tid i jord på planterester (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) og i ukrudt (Raid, Pennypacker, 1987). Værkerne fra en række forfattere (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) har vist, at udviklingen af sygdommen i kartofler og tomater stort set afhænger af tilstedeværelsen af inokulum i frø og jord. Derfor er det nødvendigt at diagnosticere (herunder kvantitativt) udbredelsen af svampen i frømaterialet, i jorden, i frø kartoffelknolde og tomatfrø lagt til opbevaring for at minimere tab fra sygdommen. Morfologisk diagnostik i jord og plantemateriale kan kun udføres ved tilstedeværelse af mikrosklerotier, som imidlertid også findes i andre typer svampe.
Symptomerne på knoldene ligner meget den sølvfarvede skorpe forårsaget af svampen Helminthosporium solani. Isolering af Colletotrichum coccodes og Helminthosporium solani i en ren kultur er ret vanskelig og tager lang tid på grund af den langsomme vækst på et næringsmedium. For hurtigt at identificere Colletotrichum coccodes er det nødvendigt at bruge instrumentale diagnostiske metoder. Den mest bekvemme metode er polymerasekædereaktion (PCR) og dens modifikation - realtids-PCR. I øjeblikket anvendes et testsystem udviklet af britiske forskere (Cullen et al., 2002) til ITS1-regionen i rDNA i Europa og USA. Dets anvendelse har vist gode resultater i analysen af russiske isolater (Belov et al, 2018). C. coccodes er imidlertid meget varierende, og dets påvisning fra en enkelt DNA-sekvens kan føre til falske negative resultater. For en mere pålidelig diagnose kræves analyse af flere artsspecifikke DNA-sekvenser, i forbindelse med hvilke vi har udviklet et originalt testsystem, der tillader identifikation af C. coccodes ved sekvensen af glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegenet.
Materialer og metoder
For at vurdere effektiviteten og specificiteten af de oprettede testsystemer brugte vi rene kulturer af 15 svampearter, isoleret af forfatterne fra de berørte prøver af blade og frugter af tomat, kartoffelknolde (tabel 1). Til isolering blev der taget planter af organer med symptomer på svampeinfektion, ikke mere end et organ pr. Busk.
Et stykke knold med en skræl, et stykke tomatfrugt og et berørt blad blev anbragt under et kikkertmikroskop, hvorefter mycelium, sporer eller et stykke væv blev overført til et agarmedium (urtagar) i en petriskål med en skærpet dissektionsnål. Isolaterne blev opbevaret i agarhældning i reagensglas ved 4 ° C.
Prøver af tomatblade til analyse med symptomer på svampesygdomme umiddelbart efter høst (i marken) blev anbragt i 70% ethylalkohol, hvori de blev holdt indtil DNA-isolering. Kartoffelknolde blev leveret til laboratoriet, skrællet (2 × 1 cm stykke) fra dem og frosset ved -20 ° С. Opbevares frossen indtil DNA-isolering.
Rene svampekulturer til DNA-isolering blev dyrket i flydende ærtemedium. Svampens mycelium blev fjernet fra det flydende medium, tørret på filterpapir, frosset i flydende nitrogen, homogeniseret, inkuberet i CTAB-puffer, oprenset med chloroform, udfældet med en blanding af isopropanol og 0.5 M kaliumacetat og vasket to gange med 2% alkohol. Det resulterende DNA blev opløst i deioniseret vand og opbevaret ved -70 ° C (Kutuzova et al., 20). DNA-koncentration blev målt ved hjælp af et HS-DNA-kvantificeringssæt til dobbeltstrenget DNA på Qubit 2017 (Qiagen, Tyskland). De alkoholiserede og frosne prøver blev tritureret i flydende nitrogen, derefter blev DNA-ekstraktion udført som beskrevet ovenfor (for myceliet af rene svampekulturer).
Tabel 1. Oprindelsen af de anvendte svampestammer
Svampe navn | Plante, orgel | Sted for markering |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | kartoffelknold | Kostroma-regionen, kartoffelknolde af 1. markgeneration, sort Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | kartoffelblad | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | kartoffelknold | Magadan-regionen, pos. Telt, kartoffelknold |
Cladosporium fulvum | tomatblad | Moskva-regionen, storfrugtet tomat |
Alternaria tomatophila | tomatfrugt | indsendt af personalet på laboratoriet for mykologi og fytopatologi ved det all-russiske forskningsinstitut for plantebeskyttelse |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomatfrugt | Krasnodar Territory, Krymsky district, grade Cream |
Fusarium oxysporum | hvede rod | Moskva-regionen |
PCR blev udført på en DTprime-forstærker (DNA-teknologi). Til PCR blev originale primere og en probe anvendt til den artsspecifikke region af glyceroltriphosphatdehydrogenasegenet: fremadrettet primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, omvendt primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primerne forstærker en 213 bp-region.
Reaktionen tog 50 ng total DNA (ved analyse af blade og knolde) og 10 ng (ved analyse af DNA fra rene svampekulturer). Reaktionsblandingen (35 pi) blev adskilt af et paraffinlag i to dele: den nederste (20 pi) indeholdt 2 pi 10 x reaktionsbuffer (750 mM Tris-HCI, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% mellem 20), 0.5 mM af hvert deoxynukleotidtriphosphat, 7 pmol af hver primer og 4 pmol af en hydrolyserbar fluorescerende sonde; den øverste indeholdt 1 pi 10 × PCR-buffer og 1 U Taq-polymerase.
Adskillelse af blandingen med paraffin gør det muligt at opbevare rørene i lang tid ved en temperatur på 5 ° C og give PCR en varm start efter opvarmning i 10 minutter ved en temperatur over 80 ° C. PCR blev udført i henhold til følgende program: 94.0 ° C - 90 s (1 cyklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cyklusser); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cyklusser); 10.0 ° C - opbevaring.
Resultater og diskussion
Sekvenserne af glyceroltriphosphatdehydrogenasegenet blev bestemt i 45 stammer isoleret fra blade, stilke, kartoffelknolde og tomatfrugter (Kutuzova, 2018) i forskellige regioner i Rusland. De undersøgte sekvenser af alle stammer blev opdelt i 2 grupper, der adskiller sig i to nukleotider. Nukleotidsekvenserne af repræsentanter for begge grupper under numrene KY496634 og KY496635 er deponeret i GenBank.
Primerne coc70gdf, coc280gdr og cocgdz-sonden designet på deres basis blev kontrolleret ved hjælp af BLAST-programmet (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) på alle sekvenser af glyceroltriphosphatdehydrogenasegenet fra arter af slægten Colletotrichum og andre organismer, der er tilgængelige i GenBank-databasen.
Ingen DNA-regioner af andre organismer, der var meget homologe med primere og probe, blev fundet.
Testsystemets følsomhed blev kontrolleret ved hjælp af prøver med forskellige koncentrationer af C. coccodes DNA, DNA fra et kartoffelblad inficeret med antracnose (opsamlet i 2017 i Mari El, sort Red Scarlett) og skræl af knolde påvirket af sort plet (opsamlet i Kostroma-regionen, sort Red Scarlett, tabel 2). For at bekræfte tilstedeværelsen af DNA i knolde og kartoffelblade blev C. coccodes-stammer isoleret fra dem i rene kulturer.
Resultaterne af testsystemets følsomhedsanalyse viser, at det kan bruges til at diagnosticere tilstedeværelsen af C. coccodes DNA i en prøve, når dets samlede indhold i PCR-blandingen er mere end 0.05 ng. Dette er helt tilstrækkeligt til påvisning, da en sclerotia i gennemsnit indeholder 0.131 ng, og en spore indeholder ca. 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testsystemet udviklet af den engelske gruppe (Cullen et al., 2002) viste en lignende følsomhed (tærskelcyklus 34 ved 0.05 ng DNA og 37 ved 0.005 ng).
Analyse af naturlige prøver indeholdende C. coccodes gjorde i alle tilfælde det muligt pålideligt at afsløre dets tilstedeværelse i prøven (tabel 2). Den foreslåede metode til DNA-isolering var også anvendelig til analyse af naturlige planteprøver.
Tabel 2. Bestemmelse af følsomheden af det foreslåede testsystem til identifikation af Colletotrichum coccodes til realtids-PCR
prøve | DNA-mængde i prøve *, ng | Tærskelcyklus | C. påvisning af coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Knoldskal 1 | 50 | 32 | + |
Knoldskal 2 | 50 | 30 | + |
Knoldskal 3 | 50 | 31.5 | + |
Kartoffelblad | 50 | 29.5 | + |
Bemærk. * I en blanding af PCR-produkter.
Testsystemets specificitet blev testet på DNA-prøver ekstraheret fra 15 svampearter. Alle svampestammer blev isoleret af forfatterne fra berørte og sunde frugter og blade af tomat, kartoffelknolde; en stamme blev isoleret fra hvederod (tabel 1). Blandt de arter, der er isoleret fra overfladen af frugten, er der også arter, der ikke er patogene for tomat (for eksempel Phellinus ferrugineovelutinus).
Undersøgelser har vist, at C. coccodes DNA blev påvist ved en tærskelcyklus på 20-27, mens andre svampearter ikke blev påvist eller gav et signal efter cyklus 40, hvilket kan tilskrives en ikke-specifik støjeffekt (tabel 3).
Tabel 3. Kontrol af testsystemet for forskellige svampetyper
Svampe navn | Tærskelcyklus |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokoder 2 | 22.6 |
C. kokoder 3 | 23 |
C. kokoder 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Bemærk. * Mængden af DNA i alle prøver var 10 ng.
Det udviklede testsystem blev brugt til at identificere C. coccodes i tomatbladprøver med symptomer på nekrotrofiske patogener og læggekartoffelknolde uden synlige symptomer. Til undersøgelsen tog vi frøknolde af forskellige sorter dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod regionerne. Tilstedeværelsen af C. coccodes-DNA blev betragtet som signifikant i prøverne, i analysen, hvoraf tærskelcyklussen ikke oversteg 35. Denne tærskelværdi blev valgt baseret på den pålidelige bestemmelse af 0.05 ng C. coccodes-DNA (tærskelcyklus 33.5, tabel 2) og det faktum tærskelcyklusser over 40 blev ikke-specifikt DNA fra nogle andre svampearter diagnosticeret. Med denne fremgangsmåde blev den signifikante tilstedeværelse af C. coccodes DNA påvist i 5 prøver af knolde dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionerne og i et tomatblad fra Yeisk-distriktet i Krasnodar-regionen (tabel 4, 5).
Tabel 4. Påvisning af Colletotrichum-koder på kartoffelknolde *
Prøvenummer | Sort af kartofler | Sted for vækst | C. påvisning af coccodes | Tærskelcyklus |
---|---|---|---|---|
1 | Rød skarlagen | Kostroma-regionen | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva-regionen | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky tidligt | Moskva-regionen | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga-regionen | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasi | Kaluga-regionen | - | |
15 | galla | Nizhny Novgorod-regionen. | - | |
16 | - |
Bemærk. * Mængden af DNA i alle prøver var 50 ng.
Tabel 5. Påvisning af Colletotrichum-koder på tomatblade *
Prøvenummer | Sted for vækst | C. påvisning af coccodes | Tærskelcyklus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-territoriet, Krim-distriktet | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-regionen, Yeisk-distriktet | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Mængden af DNA i alle prøver var 50 ng.
Det testsystem, vi har oprettet, er ikke ringere end det, der er udviklet af britiske forskere (Cullen et al., 2002) med hensyn til følsomhed og specificitet og er velegnet til analyse af planteprøver. Dens anvendelse til analyse af frøknolde gjorde det muligt at identificere C. coccodes DNA i knolde uden eksterne tegn på skade og med succes analysere infektionen af blade.
Hidtil er der ikke foretaget nogen analyse af kartoffelknolde for C. coccodes-angreb i Rusland. Vores første undersøgelse viste, at ud af 16 testede frøknolde dyrket i forskellige regioner i Den Russiske Føderation indeholder 5 C. coccodes. Dette viser, at sort plet af kartoffelknolde er en almindelig kartoffelsygdom i Rusland, og dens rolle i at reducere volumen og kvalitet af kartoffelafgrøden undervurderes.
Analyse af tomatblade afslørede en signifikant tilstedeværelse af C. coccodes DNA i et blad fra Yeisk-distriktet i Krasnodar Territory. Tidligere, når man undersøgte tomatmarker i det sydlige Rusland ved hjælp af det britiske testsystem (Cullen et al., 2002), blev der fundet blade indeholdende C. coccodes, og i nogle felter blev der fundet en høj andel af blade inficeret med C. coccodes (Belov et al., 2018). I Krasnodar og Primorsky Territories, Moskva-regionen, fandt vi tomatfrugter, hvorfra det lykkedes os at isolere rene kulturer af C. coccodes. Det er muligt, at C. coccodes er meget mere udbredt på tomat i Rusland, end man nu antager, og dets skadelighed undervurderes også.
Således er der til dato samlet nok information om den udbredte distribution af C. coccodes på kartofler og tomater.
For bedre at forstå denne svampes rolle i udviklingen af kartoffel- og tomatsygdomme er det nødvendigt at overvåge dens forekomst i Rusland, undersøge jord- og frøinfektions rolle og sort plet i tab under opbevaring. Brug af PCR-diagnostik kan i væsentlig grad lette dette arbejde, og samtidig brug af begge testsystemer vil øge nøjagtigheden af analysen betydeligt.
Dette arbejde blev støttet af det russiske videnskabsfonds tilskud nr. 18-76-00009.
Artiklen blev offentliggjort i tidsskriftet "Mycology and Phytopathology" (bind 54, nr. 1, 2020).